Immunfluoreszenz-Nachweis von zwei Thymidinanaloga (CldU und IDU) in primärem Gewebe

1. Labeling Gewebe mit CldU und IdU Lösen Sie Thymidin-Analoga (CldU oder IDU) in Wasser. Wiegen Sie 1 mg / mL des jeweiligen chemischen und fügen Sie Glasflaschen von destilliertem Wasser zu trennen. Wir bereiten in der Regel 1 Liter je zu einem Zeitpunkt. Lösen Sie die Chemikalien auf einer Rührplatte oder eine andere Form der Agitator. CldU wird in 10 min zu lösen. Rühren bei Raumtemperatur. IdU erfordert mehr als eine Stunde Rühren bei 37 ° C in einem Shaker. Wasserquellen, die beeinflussen können IdU Löslichkeit. Wenn IdU bleibt ungefederten nach über Nacht geschüttelt, versuchen Sie eine saubere Wasserquelle. Die Lösungen sind bei 4 ° C im Dunkeln gelagert. Verwalten der ersten Thymidin enthaltenden Lösung (entweder CldU oder IDU), um die Mäuse für den gewünschten Zeitraum Kennzeichnung. Nicht in Mäusen den Zugang zu unmarkiertem Wasser während der Zeit der Label haben. Wenn die benannten Kennzeichnung Zeitraum abgeschlossen ist, beginnt eine Auswaschung mit unmarkierten Wasser für mindestens 24 Stunden (das Thymidin mit Analoga Serum Halbwertszeiten von mehreren Stunden). Verwalten der zweiten Thymidin enthaltenden Lösung (entweder CldU oder IDU), um die Mäuse für den gewünschten Zeitraum Kennzeichnung. Refill Wasserflaschen regelmäßig zu verhindern Austrocknung! Alternativ können Mäuse durch sequentielle intraperitoneale Injektion von CdlU und dann IdU gekennzeichnet werden. Bereiten CldU oder IdU bei 10 mg / mL Konzentration. IdU kann verlangen, tropfenweise Zugabe von konzentrierter Natronlauge durch kräftiges Schütteln gefolgt, um in Suspension gehen. Fügen Sie nicht mehr als Natriumhydroxid. Fügen Sie einen einzigen Tropfen Natronlauge auf einen 10 mL Lösung von IdU gefolgt von einer Stunde Rühren bei 37 ° C in einem Shaker. Wenn nicht in Lösung, wiederholen Zugabe von Natronlauge. Inject 100mcg pro g Körpergewicht in den intraperitonealen Raum. Die Kontroll-Objektträger sind für dieses Protokoll. Als Ergebnis empfehlen wir dringend, Ermittler führen mehrere Variationen Thymidinanalogon Kennzeichnung Sensitivität und Spezifität zu gewährleisten. Diese sollten 1. Mäuse, die nur mit CldU markiert wurden; 2. Mäuse, die nur mit IdU markiert wurden, 3. Mäuse, die nacheinander mit CldU und dann IdU markiert wurden, 4. Mäuse, die nacheinander in umgekehrter Reihenfolge markiert wurden, zunächst mit IdU und dann CldU, 5 Mäuse, mock nur mit Wasser gekennzeichnet sind. Beim Lernen auf Etikett mit CldU und IdU, sollten die Ermittler immer führen die gesamte Protokoll mit allen 5 oben setzt der Kontroll-Objektträger aus dem Gewebe von Interesse. 2. Tissue Harvest, Fixation und Slide Vorbereitung Mit entsprechenden Betäubung durchführen tödliche Überdosis und dann Opfer der Maus über Ausbluten. Nehmen Sie frisches Gewebe und fix mit 4% paraformalehyde bei 4 ° C für 24 Stunden. Transfer-Gewebe bis 1:4 Formalin-Puffer und lagern bei 4 ° C für die Einbettung. Alternativ führen tödliche Überdosis und dann versorgen die Maus über die linke Herzkammer mit Kochsalzlösung, bis Blut aus dem Körper ausgeschieden wird, dann sofort mit 30-50 ccm 4% Paraformaldehyd perfundiert. Entfernen Sie das Gewebe von Interesse und speichern in 1:4 Formalin-Puffer bei 4 ° C für die Einbettung. Nach Gewebe Dehydrierung und Einbettung in Paraffin, schneiden 5-Mikron-Gewebeschnitte und Ort auf geladene Objektträger. Backen Sie die Objektträger bei 65 ° C für 16 Stunden, um die Haftung des Gewebes zu rutschen sicherzustellen (essentielle mit Antigen-Retrieval Schritte unten). 3. Dehydration, Permeabilisierung und Antigen Retrieval Entfernen Sie überschüssiges Paraffin durch Eintauchen Dias in zwei Xylol Bäder für 5 min. jeder. Rehydrieren das Gewebe durch Eintauchen Dias in Ethanol mit Wasser verdünnt: 100, 95, 90, 80 70 und 50%. Weichen Sie die Objektträger 3 min. bei jeder Konzentration, beginnend mit 100% und in Richtung 50% für die endgültige Eintauchen. Waschen Sie die Objektträger für 5 min. in 1x PBS. Permeabilisieren Zellen durch Eintauchen Dias in 0,2% Triton-X-Lösung für 5 min (aus frischen jedes Mal). Bereiten Sie Folien für die Mikrowellen Gewebe Antigen-Retrieval. Setzen Sie die Dias in ein Becherglas mit einem ausreichenden Volumen 0,01 M pH 6,0 Natriumcitrat-Puffer, so dass die Lösung 5 cm über dem oberen Rand des Dias zu berücksichtigen Verdampfungsverluste abdeckt. Mikrowelle gleitet, bis die Lösung kocht (3-10 min. Bei voller Leistung). Leistung reduzieren, bis die Lösung wird langsam kochendes (10-80%) und weiterhin für weitere 20 min. Überprüfen Sie in regelmäßigen Abständen, um sicherzustellen, Mikrowelle bleibt die Lösung bei einer langsamen Kochen bringen. Legen Sie Becherglas mit Dias auf einer Bank-top und lassen Sie sie vorsichtig auf Raumtemperatur (ca. 2 Stunden) cool. Bestätigen Sie, dass Objektträger bei Raumtemperatur mit einem Thermometer sind. Tauchen Sie gleitet in 1.5N HCL für 40 min. bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Objektträger zweimal in 1X PBS, 5 min. pro Waschgang. 4. Primäre und sekundäre Antikörper Es ist wichtig, dass die Folien sehr feucht durch das gesamte Protokoll zu bleiben. Dry Gewebe wird viel mehr auto-Fluoreszenz, so dass die entstehenden Bilder unbrauchbar. Um zu verhindern, zu sterben, Prozess einer Folie zu einer Zeit. Kreis jeden Abschnitt auf den Folien mit einer Flüssigkeit blockiert (dh, Wachs) pen. Legen Sie die Folien wieder in den Behälter 1x PBS. Machen Sie einen feuchten Inkubationskammer, indem feuchte Papiertücher flach auf dem Boden einer luftdichten Kunststoffbehälter. Make up Blocking Lösung von 10% Esel-Serum in 1x PBS verdünnt. Es ist wichtig, vollständig zu bedecken jeden Abschnitt mit der Lösung. Für Gewebeschnitten, die 1 x 1,5 Zentimeter sind, ist ein Volumen von 50 Mikroliter Lösung pro Abschnitt ausreichend. Fügen Sie die Blocking-Lösung, um die Folien. Entfernen Sie Folie aus 1x PBS und beseitigen die überschüssige Flüssigkeit durch leichtes Antippen des Schiebers Rand auf einem Stapel von trockenen Papiertüchern. Legen Sie gleiten in Inkubationskammer und 50 Mikroliter 10% Block-Lösung zu jedem Abschnitt. Wenn alle Folien sind in der Nähe des Containers und Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde abgeschlossen. Bereiten primärer Antikörper Verdünnung auf IdU erkennen. Verdünnen Maus-anti-BrdU in einer Konzentration 1:250 in 5% Esel-Serum in 1x PBS hergestellt. Abzweiger Block-Lösung von Bild und Ort wieder in den Brutraum. Fügen Sie die oben genannten primären Antikörper zu jedem Abschnitt beimpft und über Nacht bei 4 ° C. Bereiten hoher Stringenz gewaschen (das minimiert Bindung von Maus-anti-BrdU Antiseren gegen CldU). Make up frische salzarme TBST-Puffer (36mm Tris, 50 mM NaCl, 0,5% Tween-20, pH 8,0). Sie benötigen 40 mL Puffer pro Paar Dias. 40 ml Puffer je 50 ml konischen Rohr. Vor dem Hinzufügen von Folien, Vorwärmung der Lösung auf 37 ° C. Zwei in einer Zeit, zu entfernen Dias aus dem Brutraum, statt sie back-to-back (so dass Gewebeproben abgewandten zueinander), und tippen Sie das überschüssige Primärantikörper. Legen Sie die Folien in den Rohren mit wenig Salz TBST und Deckel gefüllt. Man schüttelt die Röhren für 20 min. in einem Schüttel-Inkubator Bakterienkultur mit der Temperatur bei 37 ° C, und die Geschwindigkeit eingestellt auf 225 Umdrehungen pro Minute. Waschen Sie die Slides zweimal in frischem 1X PBS. 5 min. pro Waschgang. Vorbereitung der nächsten primärer Antikörper-Lösung für die Erkennung von CldU und Gewebe-Antigen, falls gewünscht. Verdünnen Ratte anti-BrdU in einer Konzentration 1:250 in 5% Esel-Serum in 1x PBS hergestellt. Verdünnen primären Antiseren gegen Gewebe-Antigen auf Arbeitsebene Konzentration in den primären Antikörper-Lösung. Tippen Sie auf mehr als 1x PBS off der Folien möchten, und legen Sie sie in den Brutraum. Add primärer Antikörper zu jedem Abschnitt beimpft und über Nacht bei 4 ° C. Waschen Sie die Slides zweimal in frischem 1X PBS. 5 min. pro Waschgang. Bereiten Sie den sekundären Antikörper-Lösung. Verdünnen Cy2 Esel-anti-Ratte bis 1:250 und Cy5 Esel anti-Maus bis 1:500 in 1X PBS Lösung mit 5% Esel-Serum. Add Cy3 sekundären zu primären Arten von Gewebe-Antigen-Antiseren erkennen. Auch verdünnen 0,4 mg / ml Stammlösung von DAPI bis 1:150 in sekundären Antikörper-Lösung. Tippen Sie überschüssige 1X PBS abrutscht und in die Inkubationskammer. Add sekundären Antikörper-Lösung zu jedem Abschnitt und Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Slides zweimal in frischem 1X PBS. 5 min. pro Waschgang. Tippen Sie überschüssige 1X PBS off der Folien und haften Deckglas mit Prolong Gold-anti-fade Montage Medien (NICHT verwenden Vectashield mit dyanine Farbstoffe!). Drücken Sie auf Deckgläsern um Luftblasen zu entfernen. Lagerung bei 4 ° C. 5. Imaging and Analysis Bild des Gewebes von Interesse, mit einem Fluoreszenz-Mikroskop mit einer hohen Energie-Lichtquelle, Plan-Apochromaten, und einen hohen Wirkungsgrad Mikroskop-Kamera (z. B. Hamamatsu Orca ER) ausgestattet. Aufnehmen von Bildern in der AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (Tissue-Antigen) und Cy5 (IDU) Kanäle. Merge Bilder zu einem einzigen Multi-Layer-Bilddatei zu erstellen. Wenn richtig ausgeführt, wird DAPI gefärbte Zellkerne homogen hell ist. Tissue Antigens (zB Insulin) soll zeigen Zellen von Interesse. Wenn Färbung mit DAPI oder Gewebe-Antigen ist schwach oder inkonsistent sind, tauchen Folie in 1X PBS über Nacht zu entfernen Deckglas und wiederholen Anwendung der sekundären Antiseren. Konzentrieren Sie sich auf Gewebe-Antigen in Cy3. Überprüfen Sie CldU und IdU Färbung in Cy2 und Cy5-Kanäle, Umschalten zwischen Kanälen. Suchen Sie nach möglichen Kreuzreaktivität zwischen den Markierungen, wie durch übermäßige IdU und CldU Co-Positivität angegeben. Geben Sie für Gewebe, die nur CldU oder IdU enthalten. Mangelnde CldU oder IdU positive Kerne kann auf ein technisches Problem mit der Etikettierung oder Färbung. In diesem Fall ist für eine hoch replikativen Gewebe (zB Lymphknoten) zu suchen. Analysieren Bilder. Anzeige Schichten mit DAPI und Gewebe-Antigen. Mit einer weißen Tafel Marker in der dominanten Hand und einer Zellzahl in der nicht-dominanten Hand, markieren jeder Kern mit einem kontrastierenden Marke mit einem trockenen löschen Marker (aka white board marker). Graf DAPI-positiven Zellen im Gewebe von Interesse. Rekordwert Zellzahl. Verwenden Sie ein trockenes Radiergummi Markierungen zu entfernen. Anzeige Schichts mit DAPI-, Gewebe-Antigen, und CldU. Graf CldU positiven Zellen im Gewebe von Interesse. Rekord CldU Zellzahl, aber nicht gelöscht markiert. Anzeige ändern, um Schichten, die Gewebe-Antigen, CldU und IdU visualisieren. Graf CldU IdU doppelt positive Zellen. Rekord-Wert, löscht alle Spuren und zeigen Schichten mit DAPI-, Gewebe-Antigen, und IdU. Zählen Sie die Gesamtzahl der IdU positiven Zellen im Gewebe von Interesse. Rekord IdU Zellzahl. 6. Repräsentative Ergebnisse Wir sequenziell beschriftet 6 Wochen alte weibliche Mäuse mit CldU für eine Woche und dann IdU für zwei Wochen, durch unmittelbare Opfer gefolgt. Bauchspeicheldrüsen wurden gefärbt, um CldU, IdU und Insulin (ein Gewebe Antigen) sowie DAPI zu erkennen. Inseln wurden gleichmäßig mit Insulin gefärbt. CldU Zellkernen unterschieden sich von IdU Zellkernen (Abbildung 2). Viele Kerne außerhalb der Insel wurden CldU IdU co-positive (Abbildung 2, unten rechts, weiße Pfeile). Ein einziges Insulin positive Zelle hatte Kernfärbung für beide CldU und IdU (Abbildung 2, unten rechts, magenta Pfeil). Mäuse. Alle Experimente mit Mäusen wurden nach den Richtlinien der IACUC Ausschuss des Kinderkrankenhauses von Philadelphia durchgeführt. Weibliche B6.129 F1-Wildtyp-Mäuse wurden von Taconic (Germantown New York), an der Versuchstier Anlage am Kinderkrankenhaus von Philadelphia untergebracht und gefüttert Maus Diet 5015 von PMI Nutrition International (Richmond. Indiana) gekauft. Labeling-Strategie. Durch die Markierung der ersten Zellteilung Veranstaltung mit CldU (grün markiert in diesem System) und die zweite Zellteilung mit IdU (rot markiert in diesem Schema), sequenzielle Zellteilung führt in Zusammenarbeit markierten Zellen mit beiden CldU und IdU (grün / rot) . Repräsentative Ergebnisse von Thymidin Kennzeichnung von Pankreas-Zellen Gesamtumsatzes in Mäusen. Immunfluoreszenz-Bild von einer Maus Bauchspeicheldrüse mit Inselchen Langerhans in der Mitte. Maus wurde mit CldU für 1 Woche und dann IdU für 2 Wochen in das Trinkwasser vor dem unmittelbaren Opfer infundiert. Pancreas Probe wurde wie im Protokoll beschrieben. 40x Bilder mit unterschiedlichen Schichten angezeigt eignet sich zum Zählen. Zusammengeführt Bilder enthalten DAPI (weiß) CldU (grün), IDU (rot), Insulin (gelb). (Oben, links) DAPI und Insulin. (Oben, rechts) CldU und Insulin. (Unten, links) IDU und Insulin. (Unten rechts) CldU, IdU und Insulin. Maßstab: 100 um. Abbildung 1. Labeling-Strategie. Durch die Markierung der ersten Zellteilung Veranstaltung mit CldU (grün markiert in diesem System) und die zweite Zellteilung mit IdU (rot markiert in diesem Schema), sequenzielle Zellteilung führt in Zusammenarbeit markierten Zellen mit beiden CldU und IdU (grün / rot) . Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse von Thymidin Kennzeichnung von Pankreas-Zellen Gesamtumsatzes in Mäusen. Immunfluoreszenz-Bild von einer Maus Bauchspeicheldrüse mit Inselchen Langerhans in der Mitte. Maus wurde mit CldU für 1 Woche und dann IdU für 2 Wochen in das Trinkwasser vor dem unmittelbaren Opfer infundiert. Pancreas Probe wurde wie im Protokoll beschrieben. 40x Bilder mit unterschiedlichen Schichten angezeigt eignet sich zum Zählen. Zusammengeführt Bilder enthalten DAPI (weiß) CldU (grün), IDU (rot), Insulin (gelb). (Oben, links) DAPI und Insulin. (Oben, rechts) CldU und Insulin. (Unten, links) IDU und Insulin. (Unten rechts) CldU, IdU und Insulin. Maßstab: 100 um.