مناعي الكشف عن النظائر ثيميدين الثاني (CldU وإيدو) في الأنسجة الابتدائية
Summary
وتستمد لدينا استراتيجية للكشف عن دمج متتابعة من نظائرها ثيميدين (CldU وإيدو) في أنسجة فئران بالغة لتحديد جولتين متعاقبة من انقسام الخلايا. هذه الاستراتيجية مفيدة للكشف عن دوران خلية من خلايا أنسجة طويلة الأمد ، والتحول أنكجنيك أو خلايا العبور تضخيم.
Abstract
القياس الدقيق للانقسام الخلية هو التحدي الأساسي في مجال البيولوجيا التجريبية التي تزداد تعقيدا عندما يصبح يتم تحليل الخلايا ببطء الانقسام. الوسائل المتبعة للكشف عن انقسام الخلايا وتشمل التصور المجهري المباشر المستمر في الثقافة الخلية ، التخفيف من الأصباغ حيوية مثل succinimidyl carboxyfluorescein استر دى aetate (CFSE) ، المناعية كشف المستضدات مولد للتفتل مثل ki67 أو PCNA ، ونظائرها ثيميدين. ويمكن الكشف عن نظائرها ثيميدين جانب مجموعة متنوعة من الأساليب بما في ذلك الكشف عن الراديو لثيميدين معالج بالتريتيوم ، المناعية الكشف عن برومو deoxyuridine (BrdU) ، اللون الأخضر deoxyuridine (CldU) وiodo deoxyuridine – (إيدو) ، والكشف عن المواد الكيميائية لdeoxyuridine – استراديول (ايدو). وتستمد لدينا استراتيجية للكشف عن دمج متتابعة من نظائرها ثيميدين مختلفة (CldU وإيدو) في أنسجة فئران بالغة. لدينا وسيلة تسمح للمحققين لتحديد بدقة جولتين متعاقبة من انقسام الخلايا. عن طريق تحسين بروتوكولات immunostaining يمكن الكشف عن نهجنا منخفضة جدا نظائرها ثيميدين الجرعة المعطاة عن طريق مياه الشرب ، وآمنة لإدارة مجموعة من الفئران لفترات طويلة من الزمن. وبالتالي ، يمكن استخدام التقنية لدينا لكشف الخلية في الأنسجة دوران جدا طويلة الأمد. ويمكن تحقيق النتائج المثلى تلطيخ immunofluoresent في أنواع الأنسجة المتعددة ، بما في ذلك البنكرياس والجلد والأمعاء والكبد والغدة الكظرية والخصية والمبيض والغدة الدرقية والعقدة اللمفاوية ، والدماغ. لقد طبقنا هذه التقنية أيضا لتحديد التحول أنكجنيك داخل الأنسجة. لقد طبقنا مزيد من هذه التقنية لتحديد ما إذا كان العبور تضخيم الخلايا تساهم في النمو أو تجديد الأنسجة. في هذا المعنى ، ادارة متسلسلة من نظائرها ثيميدين يمثل نهجا جديدا لدراسة أصول وبقاء الخلايا المشاركة في توازن الأنسجة.
Protocol
Discussion
نهجنا في ثيميدين النهج القائم على وضع العلامات دوران الخلية والعديد من التطبيقات المحتملة في مجال البحوث الطبية الحيوية. حتى الآن ، فقد ركزنا على البنكرياس ، ولكن علينا أيضا تطبيق هذه الاستراتيجية لدراسة دوران خلية من خلايا الجلد والأمعاء والكبد والكلى الغدة الكظرية ، والخصية والمبيض والغدة الدرقية والعقدة الليمفاوية ، تكون الدم والمخ 1. لأن دوران الخلية يختلف من الأنسجة إلى الأنسجة ، ينبغي وضع العلامات المخصصة استراتيجيات للحصول على المعلومات الأكثر إلحاحا من الجهاز من الفائدة. تستخدم موريسون وزملاؤه CldU وإيدو : 1 كل يوم لتسمية تكون الدم 2. كوهن وزملاؤه استخدام CldU وإيدو لمدة 4 أيام للكشف عن كل انقسام الخلايا في عضلة القلب تجديد 3. في المقابل ، فقد استخدمنا CldU وإيدو لمدة تصل إلى 9 أشهر لتسمية القاعدية إجمالي قيمة التداول داخل الخلية جزيرات البنكرياس ، والأنسجة مع دوران الخلية والحد الأدنى للأعمار الحيوانات 1،4-6. التطبيق الأكثر وضوحا المحتملة لوضع العلامات لدينا استراتيجية لدراسات لتحديد معدل دوران خلية ضمن توازن الأنسجة. ولكن لدينا التقنية لديها العديد من التطبيقات الأخرى المحتملة. على سبيل المثال ، فإننا أيضا تطبيق هذه التقنية في الآونة الأخيرة لتحديد التحول أنكجنيك داخل أنسجة ، حيث يمكن تكراره في مجالات التركيز زيادة التعرف بسهولة من قبل التأسيس أو زيادة CldU إيدو 5. تستخدم موريسون وزملاؤه CldU وإيدو : 1 كل يوم لاختبار سلوك الاحتفاظ التسمية من الخلايا الجذعية المكونة للدم 2. لقد طبقنا أيضا وضع العلامات التماثلية ثيميدين متتابعة لتحديد ما إذا كان العبور تضخيم الخلايا تساهم في النمو أو تجديد الأنسجة 1. في هذه الادارة تطبيق متتابعة من نظائرها ثيميدين يمثل نهجا جديدا لدراسة أصول وبقاء الخلايا المشاركة في توازن الأنسجة.
لا ينبغي أن تستخدم نظائرها ثيميدين دون الحذر. نظائرها ثيميدين الاصطناعية والسميات المحتملة لتقسيم الخلايا ، واستخدامها من الناحية النظرية يمكن أن تؤثر في الحيوانات دوران الخلية المتنامية. وقد استخدمت ونظائرها ثيميدين radiosensitizing كلاء لمرضى السرطان ، وبطء دوران قد الخلية. وبالتالي فإننا نحث المحققين للتحقيق بحذر عن السميات المحتملة في الأنسجة اهتمامهم. على سبيل المثال ، Trumpp والزملاء وجدت أن BrdU الجهازية يمكن أن تجبر الخلايا الجذعية المكونة للدم لدخول دورة الخلية 7. على سبيل المثال ، لاحظ روتر وزملاؤه أن ارتفاع نظائرها ثيميدين جرعة سامة لتطوير البنكرياس 8. في الآونة الأخيرة هيلرشتاين وزملاؤه في KineMed ، وجدت أن شركة BrdU الادارة تبطئ داخل جزيرة الانتشار 16-25 ٪ باستخدام ملكية العلامات تقنية المياه الثقيلة 9. تضمنت استعدادات الجزيرة كلها التي يستخدمها هيلرشتاين وزملاؤه الغدد الصماء وغيرها من أنواع الخلايا غير الغدد الصماء ، والتي قد تشمل ما يصل الى 50 ٪ من مجموع الاستعدادات جزيرة. ومع ذلك ، نجد أن التسريب المطول للBrdU لا تؤثر على تكاثر الخلايا بيتا في الفئران البالغين الشباب ، كما تقاس ki67 التعبير 4. وبالمثل ، على المدى الطويل وإدارة CldU إيدو لا يبدو أن يضعف بيتا التوسع الشامل الخلية 1. وعلاوة على ذلك ، بيتا معدلات تكاثر الخلايا وتعادل بين الفئران في المسمى مع BrdU لفترات طويلة من الزمن والفئران التي وصفت فقط لبضع ساعات (تم تطبيع أسعار الفائدة لفترات زمنية ما يعادلها). معا ، وهذه النتائج تشير إلى أن الفئران يمكن أن يتسامح مع بأمان على المدى الطويل جرعة منخفضة من إدارة ثيميدين نظائرها. لا يزال ، لا يمكننا أن نستبعد السمية المحتملة من قبل نظائرها ثيميدين بيتا في البنكرياس في نمو الخلايا. نتيجة لذلك ، نواصل تنفيذ الضوابط عندما وسم الفئران مع نظائرها ثيميدين ، ونحث محققين آخرين على القيام بذلك أيضا.
لدينا أسلوب متسلسل ثيميدين العلامات التماثلية لا يخلو من العثرات والتحديات التقنية. ونتيجة لذلك ، والشرائح السيطرة ذات أهمية خاصة. لقد ولدت لنا السيطرة الشرائح التي تتكون من أنسجة مختلفة من 1) الفئران التي وصفت فقط مع CldU ؛. 2) الفئران التي وصفت فقط مع إيدو ؛ 3) الفئران التي وصفت بالتتابع مع CldU ثم تعاطي المخدرات بالحقن ؛ 4) الفئران التي وصفت بالتسلسل في ترتيب عكسي ، أولا مع إيدو وCldU ثم ؛ 5) الفئران التي هي وهمية المسمى مع الماء فقط. عندما تعلم أن التسمية مع CldU وإيدو ، وينبغي للمحققين يحمل دائما خارج البروتوكول كامل مع جميع مجموعات من الشرائح 5 أعلاه من الأنسجة من الاهتمام.
عبر التفاعل في ما بين طفيفة وCldU إيدو هو مؤسف لكن لا مفر منه الجانب السلبي لوضع العلامات على حد سواء مع نظائرها ثيميدين. وتستند هذه التقنية على إيدو CldU والاختلافات في الانتماءات في ما بين أمصال مضادة التي كانت مستمدة في الأصل ضد BrdU في الأنواع المختلفة (الفأر والفئران). بروتوكول لدينا ، في حين مرهقة ، يهدف الى تقليل التفاعل عبر هذا القبيل. وبالتالي ، فإننا نحث الحذر في أوساط المحققين الذين يعتبرون تخطي الخطوة (ق) من البروتوكول. على وجه الخصوص ، لديناواجه مشاكل مع أمصال مضادة الثانوية التي يتم التفاعل المتبادل في ما بين الفأر والفئران. يمكن التقليل من ذلك عن طريق استخدام الأمصال الضدية جاكسون التي يتم بالكامل عبر كثف في ما بين الفأر والفئران.
فشلنا في بعض الأحيان بشكل كاف للكشف عن دمج ثيميدين. في مثل هذه الحالات من المهم جدا لاستخدام الشرائح مراقبة إيجابية لتحديد أي خطوة أو كاشف لم يكن يعمل. الصعوبات التي عادة ما تكون بسبب سوء aliquots أمصال مضادة ، والشرائح الجاف ، أو permeabilization النووية غير كافية. لقد فشلنا في تسمية بنجاح الأجنة النامية مع إيدو. وبالتالي ، قد لا تكون قابلة للاختراق جميع الأنسجة لإيدو.
بدائل لCldU وإيدو لمضاعفة العلامات التماثلية ثيميدين تلوح في الأفق. يمكن ايدو (5 – استراديول deoxyuridine – 2) تكون ركيزة لحفز النحاس فوق الكشف الكيمياء 10،11. طرق الكشف ايدو لا تتطلب الفصل بين حمض النووي ، وبالتالي فهي قابلة للغاية لتحليل التدفق الخلوي بنسبة 12. EDU متوافق ولكن ليس عبر التفاعل مع BrdU 10. وقد استخدمت لقياس دوران ايدو الخلايا والأنسجة المختلفة بما في ذلك الماوس خلايا بيتا في البنكرياس 13 ، L الخلايا المعوية 14 و 15 البشرة. ايدو هي مكلفة نوعا ما في لحظة (1000 دولار امريكى لكل 500mg). لا تزال وايدو ويبدو أن الكشف عن أكثر حساسية من الكشف BrdU 10. وبالتالي ، قد يكون من المجدي اقتصاديا للجمع بين ايدو وBrdU بدلا من CldU وإيدو. هذا الأسلوب قد تسمح أيضا للكشف عن ثلاث جولات مختلفة من انقسام الخلايا في الفئران لثلاثة أسباب تسمية ايدو ، CldU ، وتعاطي المخدرات بالحقن.
باختصار ، لدينا أسلوب متسلسل ثيميدين العلامات التماثلية هو نهج جديد للكشف عن دوران الخلية. نأمل نهجنا تمكن علماء آخرون على نحو أكثر دقة تحديد انقسام الخلايا ، ونتوقع أن تفتح نماذج جديدة في توازن الأنسجة.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بدعم من JDRF ، المعاهد الوطنية للصحة (R01 – DK081469) ، ورابطة ولاية بنسلفانيا (مركز للتميز في الطب التجديدي منح 4100043362) ، ومارس من الدايمات (باسل أوكونور الباحث العلمي من بحوث جائزة كاتب) ، وجامعة ولاية بنسلفانيا التجريبية DERC ومنح جدوى (DK19525).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5-chloro-2-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedical | 0210547891 | ||
| 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | MP Biomedical | 0210035701 | ||
| 4% Paraformaldehyde | USB | 19943 | ||
| 10% Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | ||
| XYLENES | VWR | EM-XX0060-4 | ||
| Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | ||
| PBS, 10X Powder Concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | ||
| Triton –X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | ||
| Hydrochloric Acid | VWR | BDH3028-2.5LG | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | ||
| Mouse Anti BrdU | BD Pharmingen | 347580 | ||
| Rat mab anti BrdU | Accurate Chemical | OBT0030 | ||
| Cy2 donkey anti-rat | Jackson Immuno | 712-225-153 | Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity). | |
| Cy5 donkey anti-mouse | Jackson immuno | 715-175-151 | See above | |
| Glass Cover Slips | Sigma-Aldrich | C9056-1CS | ||
| YFP Filter | Chroma | 49003 ET EYFP | Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel | |
| Cy3 Filter | Chroma | 49004 ET Cy3 | ||
| Cy5 Filter | Chroma | 49006 ET Cy5 | ||
| ORCA ER Microscope Camera | Hamamatsu | C4742-95-12ER | Excellent detection of fluorophores | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes). |
Referências
- Teta, M. Growth and regeneration of adult Beta cells does not involve specialized progenitors. Dev Cell. 12 (5), 817-817 (2007).
- Kiel, M. J. Haematopoietic stem cells do not asymmetrically segregate chromosomes or retain BrdU. Nature. 449 (7159), 238-238 (2007).
- Bersell, K., Arab, S., Haring, B., Kuhn, B. Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury. Cell. 138, 257-257 (2009).
- Rankin, M. M., Kushner, J. A. Adaptive Beta Cell Proliferation Is Severely Restricted with Advanced Age. Diabetes. , (2009).
- He, L. M. Cyclin D2 Protein Stability Is Regulated in Pancreatic Beta Cells. Mol Endocrinol. , (2009).
- Kushner, J. A. Beta-cell growth: an unusual paradigm of organogenesis that is cyclin D2/Cdk4 dependent. Cell Cycle. 5 (3), 234-234 (2006).
- Teta, M. Very slow turnover of beta-cells in aged adult mice. Diabetes. 54 (9), 2557-2557 (2005).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1118 (2008).
- Van Nest, G., Raman, R. K., Rutter, W. J. Effects of dexamethasone and 5-bromodeoxyuridine on protein synthesis and secretion during in vitro pancreatic development. Dev Biol. 98 (2), 295-295 (1983).
- Githens, S., Pictet, R., Phelps, P., Rutter, W. J. 5-bromodeoxyuridine may alter the differentiative program of the embryonic pancreas. J Cell Biol. 71 (2), 341-341 (1976).
- Walther, B. T., Pictet, R. L., David, J. D., Rutter, W. J. On the mechanism of 5-bromodeoxyuridine inhibition of exocrine pancreas differentiation. J Cell Biol. 249 (6), 1953-1953 (1974).
- Chen, S. Measurement of pancreatic islet cell proliferation by heavy water labeling. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (5), E1459-E1459 (2007).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2415 (2008).
- Best, M. D. Click chemistry and bioorthogonal reactions: unprecedented selectivity in the labeling of biological molecules. Bioquímica. 48 (28), 6571-6571 (2009).
- Buck, S. B. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2′-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44 (7), 927-927 (2008).
- Huising, M. O. CRFR1 is expressed on pancreatic beta cells, promotes beta cell proliferation, and potentiates insulin secretion in a glucose-dependent manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 912-912 (2008).
- Reimann, F. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metab. 8 (6), 532-532 (2008).
- Doupe, D. P., Klein, A. M., Simons, B. D., Jones, P. H. The ordered architecture of murine ear epidermis is maintained by progenitor cells with random fate. Dev Cell. 18 (2), 317-317 (2010).
