RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Gerekçe Thermo Scientific Dharmacon oligos, 50 80-mers kullanımı istismar, burada oligos hedef kromozomal DNA tavlama aşağıdaki maya hücreleri genomik DNA genetik bilgi aktarabilirsiniz hangi bir gen düzeltme testi dayalı bir prosedür mevcut. Oligos tarafından hedef Başarılı beklenen fenotip gösteren maya kolonileri görünümünü tarafından atılırsa. Istenilen genetik modifikasyon oligo dizisi dahil bir veya daha fazla ribonucleotides içinde yapılır ise, genetik bilginin RNA yolu böylece kromozom hedef DNA, kromozom seviyesinde hedefleme işlemi sırasında bir RNA / DNA hibrid formları doğrudan akar. Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren oligo ribonukleotid / s DNA onarım sentezi yoluyla hedef gen için şablon olarak hizmet edebilir ya da DNA içine gömülü olabilir ve DNA replikasyonu sırasında şablon olarak hizmet vermektedir. Bu deneylerde maya / Saccharomyces cerevisiae / ökaryot model sistemi kullanmak; Ancak, benzer bir yaklaşım, diğer organizmalar veya hücre tipleri de uygulanabilir . Bu video, biz bir hedef maya genomik lokus homoloji ile tasarlanmış bir Thermo Scientific Dharmacon oligo ve hedef gendeki bir mutasyon düzeltmek için ortada bir ribonukleotid içeren. RNA içeren oligo dönüşüm sonra, belirli bir frekansta, oligo RNA yolu kromozomal DNA içine dahil ve DNA replikasyon sırasında DNA sentezi için şablon olarak hizmet olabilir gösterir hedeflenen sitenin düzeltme gözlemliyoruz. RNA yolu içinde taşınan genetik bilgi stably aşağıdaki hücre nesillere aktarılır. Burada Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren oligo ve yaklaşım kromozomal DNA aktarılması RNA bilgilerini tespit etmek için maya hücre dönüşüm adımları açıklar. A. RNA içeren Oligo Bu Deney tasarımı kullanılan Maya bir genetik kusur düzeltmek için bir RNA içeren oligo tasarladık S. trp5 lokustaki cerevisiae kromozomal DNA. Protokolünde kullanılan maya suşu, iki baz silinmesi ve bir saçmalık mutasyon (Şekil 1A) ile bir mutant gen trp5 içerir . Böyle bir maya suşu, triptofan auxotrophic mutant ve triptofan olmadan medya koloniler teşkil etmemektedir. TRP5 geninin DNA dizisi Saccharomyces Genom Veritabanı (http://www.yeastgenome.org/) kullanılabilir. Bu protokolde kullanılan Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren oligo 2-baz DNA ekleme, silme mutasyon ve trp5 allel (Şekil 1A) anlamsız mutasyon düzeltmek için tasarlanmış bir ribonukleotid düzeltmek için tasarlanmış 65-mer, . Oligo sırası şu şekilde tasarlanmıştır: 5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-rG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Bu oligo 200 nM ölçekte Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) tarafından sentezlenir ve desalted, deprotected SAYFA arıtma olmadan kullanılamaz. Maya Dönüşüm RNA içeren Oligo (Storici ark değiştirilmiş, 2007 1) B. Hazırlık Oligo tüpleri dahil olmak üzere bir deney, pipetler, girdap, raflar, deneysel alan ve her şeyi başlamadan önce potansiyel RNaz kontaminasyonu temizlemek için RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile araştırmacı tarafından giyilen eldiven için kullanılacak malzemeler silin. RNaz içermeyen su, kimyasal reaktifler, tüpler ve tüm adımları pipet uçları kullanın. Bu deneyde her adım RNaz arındırılmış olmalıdır. Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren oligo şirketten 250 pmoles / ul stok solüsyonu RNaz ücretsiz su ve pelet çözmek için gayretle vorteks alınan süspanse edin. -80 ° C saklayınız Dönüşüm hemen önce, buz üzerinde RNA içeren oligo Çözülme ve RNaz ücretsiz tüpler RNaz içermeyen su ile 50 pmoles / ml ye tamamlanır. Her dönüşüm RNA içeren oligos 1 nmole gerektirir. Oligos ikincil yapıları ortadan kaldırmak için 2 dakika süreyle 100 ° C ısıya blok RNA içeren oligos seçilmiş bir miktar denatüre. Denatürasyon sonra hemen buz tüpü yerleştirin. Dönüşüm kadar buz üzerinde tutun. Karşılık gelen bir deneyde kontrol olarak DNA sadece oligo kullanılır. Bu oligo -20 ° C den yukarıda açıklandığı gibi, çözülmüş ve RNA içeren oligo olarak dönüşüm için hazırlanmıştır. C. RNA içeren Oligo kullanarak Maya Hücreleri Dönüşüm Trp5 mutant maya hücreleri ile zengin YPD sıvı bir ortamda 5 ml inoküle edin ve 30 ° C gecede (bkz. Malzemeleri) büyümeye. 50 ml YPD sıvı ortam içine 1.5 ml gecelik kültür aktarın. 4 saat için 30 ° C çalkalayıcı (225 rpm) hücreler inkübe edin. Çözüm 1 ve Çözüm 2 imm hazırlayınediately önce RNaz ücretsiz tüpler dönüşüm (Malzeme bakınız). 50 ml RNaz ücretsiz tüp ve 2 dakika süreyle 1562 g karşılık gelen 3000 rpm dönüş için hücre kültürü aktarın. Hücre yağış pelet yaklaşık. 0.3 cm 3. 50 ml, 2 dakika süreyle 3000 rpm'de RNaz ücretsiz su ve spin ile süpernatant ve yıkama hücreler çıkarın. Orta mümkün olduğunca mevcut olabilir kültür ortamı ve RNases kurtulmak için adım 6 5 kez tekrarlayın. Çözüm 1 ve 2 dakika süreyle 3000 rpm'de spin 5 ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Çözüm 1 250 ul supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Bu hücre miktarı 7-8 dönüşümler için yeterli. Kısım 50 ul RNaz ücretsiz mikrosantrifüj tüpler hücre süspansiyonu, 20 ul RNA içeren oligo çalışma çözümü (1 nmole), ya da sadece DNA-oligo çalışma çözümü (1 nmole), ya da steril su 20 ul 20 ul negatif kontrol için bir oligo. Sonra her bir dönüşüm tepki için 300 ul Çözüm 2 ekleyin. Kendileri gibi taşıyıcı oligos hareket olarak, dönüşüm sürecinin somon sperm DNA eklemenize gerek yoktur. Vortex şiddetle homojen karıştırın. 30 ° C de 30 dakika bir çalkalayıcı dönüşüm reaksiyonları inkübe edin. Isı şoku 42 ° C de 15 dk. 4 dakika süreyle 2236 g, 5000 rpm devir hızına karşılık gelen hücreler aşağı spin. 100 ul steril su supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Bu hücre süspansiyonu bir kısım alın ve 100.000 kat ve yaklaşık kullanarak bir YPD plaka plaka hücreleri tarafından steril su ile seyreltilmiş. 30 – 15 steril cam boncuk ve inkübe ° C 2 gün boyunca. Plaka yeniden süspanse hücrelerin her biri yaklaşık kullanarak triptofan (SC-Trp) olmadan sentetik tam katı besiyeri Petri kabı dönüşüm reaksiyonu. 30 – 15 steril cam boncuk ve inkübe ° C 4-5 gün (Şekil 2). RNA içeren Oligo D. Gen Düzeltme Analizi RNA içeren oligo için gen düzeltme frekansı hesaplamak için seçici besiyeri (Şekil 2) yanı sıra YPD orta yetiştirilen kolonileri, DNA tek oligo ve hayır-oligo kontrol sayısını. Elde edilen sayı karşılaştırın. Spontan reversion oranı iki-baz silme ve anlamsız mutasyon trp5 allellerin kullanılan maya suşu 10-9 daha azdır, dolayısıyla biz hiçbir oligos hücreleri eklenir seçici orta koloniler oluşturulmasını bekliyoruz. Birkaç dışarı Streak rastgele tek koloni izolatları elde etmek için orta YPD üzerine transformant koloniler aldı. Koloni büyümesi için iki gün bekleyin, sonra birkaç (en az 5) tek koloniler ve YPD ve seçici orta yamalar yapmak. Koloni PCR (Şekil 1B) RNA içeren oligo tarafından hedef bölge (250-1,000 bp) yükseltmek için bir çift astar tasarlayın. (Storici ve Resnick değiştirilmiş, 2006 2) aşağıdaki gibi koloni PCR prosedürü. Süspanse edin hücreleri (yaklaşık 1 mm3) su 50 ul bireysel yamaları alınan ve 1 adet lyticase ekleyin. 100 ısı blok inkübasyonu takiben 10 dakika, ° C çözüm hücreler ve bırakın genomik DNA kırmak için 5 dakika oda sıcaklığında inkübe PCR koşulları: PCR reaksiyon hücre tabanda çözüm ul içeren 10, 50 pmoles ileri ve geri primerler, 10 mM dNTP, Taq polimeraz 1 birim, 10x tampon ve 5 ul 1 ul steril su ile ayarlanır. 50 ul son hacim. 30 devir 95 30 s, 30 s: 55 ° C ° C ve 1 dakika 72 ° C;; son uzatma süresi 7 dakika 72 ° C, daha sonra örnekleri PCR programı 95 ° C'de 3 dakika 4 tutulur ° C Bu tepkime için bir uzatma süresi 1 dakika kb / varsayılır. PCR ardından, örnekler PCR ürünü gözlem için% 1 veya% 2 (PCR ürünü beklenen boyutuna göre) agaroz jel (Şekil 3) üzerinde çalışmaktadır. RNA içeren oligo tarafından aktarılan genetik bilgi maya genomik hedef bölgede yeni bir kısıtlama sitesi (Şekil 1B) oluşturuyorsa, bu, uygun bir restriksiyon enzimi ile PCR ürününün sindirerek doğru bilgi transferi doğrulamak mümkün. RNA içeren oligo tarafından üretilen herhangi bir sınırlama sitesi ise, 6. adıma gidin. Digest belirli bir restriksiyon enzimi kullanılarak PCR ürünleri. Sindirim reaksiyonu restriksiyon enzimi ul PCR ürün, tampon, BSA (bazı enzimler için kullanılan enzim için talimat gerekli olmayabilir), 0.5 ul, 6 ve 15 ul steril su içerir. Numuneler kullanılan enzim için spesifik sıcaklığında 1 saat inkübe edilir. Genetik modifikasyon gözlemlemek için% 2 agaroz jel aynı satırda sindirilir örnekleri ile birlikte sindirilmemiş bir örneği çalıştırmak b transferRNA içeren oligo y RNA yolu (Şekil 3). PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünleri arındırmak ve DNA dizi analizi için onları hazırlamak. Ürün yükseltmek için kullanılan aynı primerler ile sıralama için örnekler gönderin. Seçilen bir referans dizisi (Şekil 4) ile birden fazla dizilerinin uyum sağlayan bir yazılım kullanarak DNA dizi analizi sonuçları analiz edin. E. RNA içeren oligo Alkali Arıtma (Şekil 5) Her reaksiyon için RNA içeren oligo veya DNA-oligo 1 nmole (250 pmoles / ml stok solüsyonu 4 ul), 1.5 ml tüp içine ekleyin. Hidroliz 1 M NaOH 4 ul ekleyin ya da alternatif olarak negatif kontrol olarak 1 saat 4 ul H 2 O ekleyin ve bir su banyosunda 65 ° C'de inkübe Daha sonra su banyosunda buz hareket ettirin. 2 ul 1.2 M HCl, H 2 O 1 M Tris-HCl ve 4 ul ul 4, ya da alternatif olarak H 2 O 6 ul ve negatif kontrol için 1 M Tris-HCl 4 ul ile nötralize edin. Dönüşüm kadar buz üzerinde tutun. Şekil 1. Kusurlu trp5 gen ve RNA içeren oligo düzeltilebilir TRP5 allel şematik diyagramı.) Trp5 mutant gen 2-baz silinmesi (siyah üçgen) ve 1-baz saçmalık mutasyon (yıldız) içerir. Tek iplikli RNA içeren 2-baz ekleme (mavi döngü) ve bir Van91 I restriksiyon enzimi sitesi (braket gösterilen) üreten 1-RNA baz ikame (kırmızı dikdörtgen) oligo genetik kusurları düzeltmek için maya hücreleri dönüştü. trp5 gen. B) TRP5 genin RNA içeren oligo (düzeltilmiş üsleri mavi dikdörtgenler olarak belirtilmiştir) tarafından onarıldıktan sonra, Van91 I site TRP5 gen oluşturulur. TRP5 gen sadece bir Van91 I restriksiyon sitesi de dahil olmak üzere 278 bp parçası PCR primerleri bir çift (P1 ve P2) tarafından yükseltilir. Van91 P1 ve P2 PCR ürününün sindirim sonra oluşturulan 177 bp ve 101 bp parça de gösterilir. Şekil 2. RNA içeren oligo Dönüşüm sonucudur.) Maya hücreleri hiçbir oligo ile dönüştürülmüş SC-Trp ortamda herhangi bir koloni oluşturmak yok, plakaları ab bakın. B) Tabaklar cg show maya kolonileri SC-Trp büyüyen hücreleri sonra RNA içeren oligo 1 nmole dönüşür. C) Tabaklar hl show maya kolonileri SC-Trp büyüyen hücreleri sonra 1 nmole ile ilgili DNA tek kontrol oligo dönüşür. Şekil 3. Genetik bilgi aktarımı Algılama RNA içeren hedeflenen genomik bölge P1 ve P2 ile amplifiye Van91 I restriksiyon enzimi ile sindirilir PCR örneklerinin% 2 agaroz jel elektroforezi yükseltme PCR ürün sınırlama sindirim maya kromozomal DNA oligo. Lanes 1, 8 ve 15, 100 boyutları, 200, 300, 400 ve 500 bp DNA merdivenin sol tarafta belirtilen şeritli 2, PCR trp5 mutant suşunun genomik DNA amplifiye trp5 lokus ürünü; 3 şeritli, PCR şeritli 9 14 ürün sadece DNA-oligo tarafından hedeflenen bir Trp + koloni elde edilen genomik DNA amplifiye; Van91 I sınırlama sindirim şeritli 4-7, PCR ürünleri elde edilen genomik DNA, RNA içeren oligo tarafından hedef Trp + koloniler amplifiye 2 ila 7 şerit PCR ürünleri. 10 ila 14 şerit kesilmemiş PCR ürün gruplarından varlığı TRP5 lokus (CCACATTCTGG) Van91 Ben kısmi sindirimi ile açıklanabilir. Van91 (CCANNNN NTGG) için kesme sitenin birden çok dizileri göz önüne alındığında, TRP5 oluşturulan site enzim için en uygun hedef olmayabilir. Aslında, yukarıdaki tüm PCR ürünleri sıralama aşağıdaki DNA (bkz. Şekil 4) oligos tarafından yapılan dışında herhangi bir ek değişiklikleri algılamak. Van91 P1 ve P2 astar ve sindirim ürün grupları ile amplifiye 278 bp PCR bant, 177 bp ve 101 bp sağdaki oklarla gösterilmiştir . Şekil 4. RNA içeren oligo gen düzeltme gösteren DNA dizi analizi sonuçları. Genomik bölge A) DNA Elektroferogram RNA içeren oligo tarafından hedef. DNA dizisi (kutulu mavi) G RNA içeren oligo rG türemiştir. Ayrıca kutulu CG üslerinin yerleştirilmesi. Diğer tüm PCR ürünleri sonuçlar Sıralama floresan sinyalleri ile arka plan üzerinde, aynı zamanda bu kadar net. B) Trp + transfo TRP5 bölge DizilerDNA sadece oligo (T1) ve RNA içeren oligo (T2-T5), üstünde fikir birliği sırayla maç ve hedef rmants (Genomik DNA, kırmızı oligos göre hedefleme önce trp5 mutant hücreler ile karşılaştırıldığında gölgeli). Onarım RNA içeren alt oligo iki temel DNA ekleme ve tek-baz (G) kırmızı ile işaretlenmiş RNA ikame vardır. Sarı gölge gösterisi ile mavi kutulu bölgelerde RNA içeren DNA sadece oligo oligo olarak sıra tam silme mutasyon ve tüm test örnekleri anlamsız mutasyon düzeltildi. Kesik çizgiler RNA içeren oligo dizisi konumu işaretleyin. Lütfen Şekil 4 büyük halini görmek için buraya tıklayın . Şekil 5. Alkali tedavi RNA içeren oligo gen düzeltme önler. RNA içeren oligo (R) dönüşümü frekans, kırmızı çubuğunda ve mavi çubuk sadece DNA-oligo (D) gösterilir gösterilir . Hata çubukları her oligo için 3 bağımsız dönüşümler için ortalama standart hata temsil eder. DNA sadece oligo NaOH tedavi ile benzer frekans dönüşüm olmadan ve görüntüler. Farklı NaOH ile 0 tedavisi sonrasında, RNA içeren oligo dönüşüm frekans düşer. Bu nedenle, RNA içeren oligo hazırlık DNA sadece oligo ile kontamine değildir, bu nedenle, gözlenen dönüşüm frekans RNA içeren oligo özel.