Electroeluting شظايا الحمض النووي
Summary
هذا الإجراء يسمح للتنقية مع شظايا الحمض النووي عالية الغلة.
Abstract
وتستخدم شظايا من الحمض النووي لأغراض مختلفة المنقى في البيولوجيا الجزيئية ، ويمكن أن يكونوا مستعدين من خلال إجراءات عدة. معظمها تتطلب الكهربائي السابقة للشظايا من الحمض النووي من أجل فصل عصابة من الفائدة. ثم ، يتم رفعه من هذه الفرقة من agarose هلام أو الأكريلاميد وتنقيتها باستخدام إما : ملزمة وشطف الزجاج أو من جزيئات السيليكا ، والأغشية ثنائي إيثيل أمينو إيثيل السليلوز ، "سحق ونقع الأسلوب" ، electroelution أو في كثير من الأحيان مكلفة تنقية مجموعات تجارية. وبالتالي ، فإن اختيار الأسلوب يعتمد في الغالب على ما يتوفر في المختبر. الإجراء electroelution يسمح احد لتنقية الحمض النووي نظيفة جدا لاستخدامها في عدد كبير من التطبيقات (التسلسل ، radiolabeling ، وتقييد الأنزيمية ، وتعديل الأنزيمية ، الخ الاستنساخ). يتكون هذا الإجراء في وضع الحمض النووي الفرقة التي تحتوي على مادة الأكريلاميد agarose أو شرائح داخل الآبار عينة من electroeluter ، ثم تطبيق الحالية سيجعل جزء الحمض النووي لمغادرة agarose وبالتالي يكون محاصرا في وسادة الملح التي سيتم استردادها في وقت لاحق عن طريق الترسيب الايثانول.
Protocol
Discussion
ومدة تشغيل تعتمد بشكل كبير على حجم الشظايا ، شظايا عادة لمدة تصل إلى 20 كيلو بايت 50 دقيقة إلى 1 ساعة ويكفي ، في حين أن أجزاء صغيرة مطلوب ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمتابعة كل 10 دقائق لمنع شظية من خلال الذهاب الى وسادة الملح وبالتالي الى الغرفة العازلة مصعدي انخفاض الانتعاش. فمن المهم للتأكد من أنه عند تعيين إمدادات الطاقة الخاص في 100 فولت ، وهناك ما لا يقل عن mAmp الحالية من 10. يمكن رصد الفرقة الحمض النووي باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية من ناحية وكشف هذا عندما يتخلى عن شريحة هلام. يمكن أيضا أن تكون وسادة الملح مع 3 خلات نا م.
هذا الإجراء يسمح radiolabeled تنقية شظايا الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي من أحجام مختلفة مع انتعاش جيدة (~ 80 ٪) ، هضمها بواسطة إنزيمات التقييد ، التي تتم معالجتها بواسطة الانزيمات تعديل ، إلخ.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل العمل في المختبر من قبل الدكتور برموديز CONACYT (المنحة # 82622) ، ونشكر غابرييلا جوتيريز ، سوسا ، Eliuth رييس – مارتينيز ورودريغيز زيمينا توريس لتسجيل الفيديو الإجراء electroleution.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NdeI | New England Biolabs | R0111L | ||
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | ||
| NH4 acetate | JTBaker | 0596 | ||
| agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
| Biophotometer | Eppendorf | 6131 000 020 | ||
| Electroeluter | IBI | UEA CAT 46000 |
Referências
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
