İnsektisit Direnci İzleme için biyoanalizlere

1. Giriş Gıda üretimi, 2025 yılına kadar dünya nüfusu 8,04 milyar insan 1 ulaşacağı gerçekleştirilmesi son derece önemli hale gelmiştir . Şu anda üretilen gıda ürünlerinin daha büyük bir miktarda sağlamak için ihtiyaç olacaktır. Yeterli gıda temini gibi pestisitler gibi bitki koruma ürünlerinin miktar mahsul veriminin artırılması ve kalitesini korumak için kullanmadan yeteneğine sahip olmayacaktır. Pestisitler tarihi ve güncel güvene dayanarak, pestisit direniş örnekleri oluşmaya devam edecek ve bilimsel literatürde bildirilmiştir. Zararlı böcek böcek ilaçlarına karşı direnci, yüksek verimli ve kaliteli üretim tarım ürünleri ayrılmaz bir parçası olduğu için sorunludur. Ancak, aşırı ve / veya bir pestisit kötüye bitkisel üretim için zararlı olabilir direnç gelişimine yol açabilir. Zararlıları (yani, böcekler, yabani otlar, patojenler, vb.) Çeşitli mekanizmaları ancak direnç gelişimi için önemli bir itici faktör kayıtlı pestisit kullanımı için mevcut eylem bağımsız modları ile 1 eksikliği olan direnç gelişir. Birkaç ürünler, belirli bir ürün sistem içinde ayrı bir haşere etiketlenir, kimyasal kontrol seçenekleri sınırlıdır. Bu nedenle, aynı kimyasal (ler) tekrar tekrar kullanılan ve sürekli seçim basınç haşere üzerine yerleştirilir. Haşere tek bir yıl içinde birden fazla nesiller ve her nesil pestisit maruz kaldığında, bu sorunu daha da derinleştirdi. Direnç 2 ile ilgili mali ve enrivornmental maliyetleri vardır. Zararlı böcek direnç tatmin edici kontrolü sağlamak için gerekli yüksek oranları ve pestisit daha sık uygulamalar yol açar. Verim kayıpları hedef haşere kontrol başarısızlık nedeniyle pestisit kullanımının artırılması sonra da ortaya çıkması muhtemeldir. Pimentel 2 yıllık yaklaşık 1,5 milyar ABD doları olması, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki pestisit direnci bu maliyetler tahmin ediyor . Haşere popülasyonlar arasında pestisit duyarlılık Anketler, böcek ilacı performans herhangi bir kayma tespit ve kimyasal kontrol stratejileri değiştirmek için bir erken uyarı sağlamak için proaktif bir yaklaşım. Genel IPM stratejilerini değiştirerek, belirli bir pestisit canlılığı da, tarım için dünya için yeterli gıda ve lif vermeye devam etmek için önemli olan, daha uzun olabilir. Bu yazıda, insektisit duyarlılık izlemek ve temas böcek yetişkin flakon test 3 kullanarak insektisit dirençli popülasyonların geliştirme ve bitki sistemik böcek 4 için bu testin bir değişiklik tespit etmek için kullanılan bir protokol anlatacağız. 2. Yöntemleri 2.1 Güvenlik Bildirimi Böcek ile ilgili doğru güvenlik önlemleri kullanmak önemlidir. Pestisitler dokunmadan önce uygun Kişisel Koruyucu Ekipman (KKE) Malzeme Güvenlik Bilgi Formu (MSDS) danışın. Laboratuvarlarda pestisit işleme özel laboratuvar personeli tarafından eğitim, herhangi bir biyoanalizlere çalışmadan önce gerekli olmalıdır. Yapımı 2.2 Stok Çözüm Insektisit aktif madde (AI) bir kaynaktan bilinen bir konsantrasyon stok solüsyonu geliştirin. Biyoassay tedaviler orijinal stok solüsyonu yapılacaktır olarak istenen tüm konsantrasyonları dahil. Bu çalışmada, 100 mg / ml solüsyon 100mls stok solüsyonu olarak geliştirilen olacak faiz için, ancak, herhangi bir konsantrasyonu bu ilk konsantrasyon sulandırılmış olabilir. Yüzde saflık göre tartılması gereken bir teknik notu AI miktarını ayarlayın. Tutar tartılır = (yapmak hacmi) X ([# mg / ml solüsyon] / [% purity/100]) Örneğin, teknik AI 10152.284 mg 100 ml,% 98.5 saflıkta bir teknik notu insektisit bir 100 mg / ml solüsyon yapmak gerekir: (100 ml) X ([100μg/ml] / 0,985) = 10.152,284 mikrogram 2.2.1 İletişim İnsektisitler Yetişkin Flakon Test Kısmen aseton ile bir ölçülü balona doldurmak ve ayarlanan miktarda insektisit AI tartmak. Tartmak tekne tüm insektisit kaldırmak için balonun içine ağırlık tekne aseton ile durulayın. Aseton ile mezuniyet hattına ölçülü balona doldurun. Çoğu çözümleri soğutmalı koşullarda gerçekleştirilen etkinlik yaklaşık bir ay boyunca kayda değer kaybı ile faaliyet devam edecektir. Sistemik İnsektisitler Yetişkin Flakon Testi 2.2.2 Modifikasyon Sistemik böcek böceklerin Zehirlenme temas ürünler farklı. Sistemik ürünler genellikle doğrudan exposur sahip böcek yerine aktif hale böcek tarafından alınması gerekire temas böcek gibi ürün. Bu nedenle, yetişkin flakon test, test edilecek sistemik böcek için güncellenmiştir. Stok çözümü için gerekli olan AI ağırlığı, bölüm 2.2 'de belirtilen e benzer hesaplanır. Su çözeltisi: metodolojisi, AI,% 10'luk bir kilo bal ile çözülür dışında benzer. Bu çözüm biyoassay başlandıktan 24 saat içinde yapılmalıdır. Aseton karışımı bal eklenir: teknik sınıf malzeme suda çözünebilir değilse, böcek ilacı, böcek ilacı çözüm yüksek bir konsantrasyon sadece küçük bir hacim gibi aseton ile yapılabilir su solüsyonu 4 . 2.3 Konsantrasyonlar Range belirlenmesi ve geliştirilmesi Konsantrasyonları Biyoassay yanıtların kurmak için gerekli olan uygun konsantrasyonlarının belirlenmesi zor olabilir. Birkaç tekrarlamalı konsantrasyonlarının aralığı tanımlamak için gerekli olabilir ve bu deneme yanılma yolu ile yapılır. Ayrıca, nüfusu duyarlılık düzeyleri değişiklik olursa aralığı zamanla değişebilir. Son konsantrasyonları kurarak çeşitli başka faktörler de göz önünde bulundurulmalıdır ve olmalıdır: böcek ailesi, böcek ilacı sınıfı, böcek boyutu, vs Daha önce yetişkin flakon testlerin sonuçları insektisit konsantrasyonları ilk seçim yardımcı olabilir yayınlandı. 15 Thripidae; Coleoptera: Brentidae 16, 17, Curculionidae Coccinellidae 18-19 ve Cybocephalidae 19; Diptera: Culicidae; Hemiptera: Thysanaptera Aleyrodiidae 5-6, Aphididae 7, Pentatomidae 8-10 ve Miridae 11-14 biyoanalizlere yayınlanmıştır 20; Lepidoptera: Tortricidae 21 ve Noctuidae 3, 22-26; Hymenoptera: Braconidae 7,18 Ichneumonidae 26-27, Aphidiidae 18, Encyrtidae 7, ve Aphelinidae 18. Konsantrasyonları "X" mikrogram / ml solüsyon göre yapılır. Ancak, şişeleri yetişkin flakon test için hazırlanan, sadece 0.5 ml her flakon eklenebilir; bu nedenle, flakonun konsantrasyonu yarım konsantrasyonu yapılır. Bir kez seçilen konsantrasyonları, aşağıdaki denklem çözüm tutarının belirlenmesinde yardımcı olabilir istenen konsantrasyona yapmak için eklenen. (C1) (V1) = (C2) (V2) C1 stok solüsyonu konsantrasyonu; C2 hazırlanmaktadır konsantrasyonu; V1 yeni konsantrasyon yapmak için gerekli stok hacmi ve V2 yeni konsantrasyon hacmi. Örneğin, bir 100μg/ml stok solüsyonu 5mls bir 5μg/ml bir 100mls yapmak için gereklidir. Bu 5μg/ml çözüm 2.5μg/vial bir konsantrasyon kaplı şişeleri neden olacaktır. 5mls = [(5μg/ml) (100mls)] / (100μg/ml) 2.3.1 İletişim İnsektisitler Yetişkin Flakon Test Kısmen istenen konsantrasyona yapmak için gerekli stok solüsyonu hesaplanan miktarı volumetrik flaks doldurun ve kısım. Ölçülü balona mezuniyet hattına aseton ile doldurun ve daha sonra kullanmak üzere buzdolabında saklanması için bölüm 2.4 veya mühür Parafilm M (Alcan Inc, Neenah, WI) ile devam edin. Çoğu çözümleri 1 ay boyunca iyi. Sistemik İnsektisitler Yetişkin Flakon Testi 2.3.2 Modifikasyon Bu süreç, aseton yerine su çözeltisi:% 10'luk bir kilo bal dışında daha önce 2.3.1 'de belirtildiği gibi aynıdır. Su solüsyonu istenen tüm konsantrasyonlarını yapmak için yeterli bal karıştırın. Bu çözümler hazırlanması 24 saat içinde kullanılmalıdır. Şişeler, 2.4 Hazırlık 2.4.1 İletişim İnsektisitler Yetişkin Flakon Test Konsantrasyonları buzdolabında saklanır olsaydı, ortam sıcaklığına kadar ısınmasını bekleyin. Insektisit konsantrasyonu etkileyebilir sıcaklığa bağlı aseton değişiklikler hacmi. Boya ya da kalem kullanarak konsantrasyonları için renk kodu 20 ml cam şişe (vidalı kapaklar için takılan). 0.5ml/concentration sunmak için yinelenen bir pipet ayarlayın. En düşük konsantrasyon ile takip eden ve tüm konsantrasyonlarda kullanılır kadar artan dozlarda devam aseton kontrolü ile çalışmak başlatın. Küçük bir beher tedavi edilmesi şişeleri gerçek sayı (yani, 40 şişeleri için 20mls) olarak yaklaşık yarım hacmi çözüm dökün. Çözüm kullanımda değilken, konsantrasyon değişikliklerine neden olabilir buharlaşmasını en aza indirmek için örtün. Yinelenen pipet içine böcek ilacı çözüm çizin ve bireysel cam şişe içine 0.5 ml çözüm dağıtmak. Tedaviden hemen sonra, cam şişe, ticari bir hot dog silindir üzerine yerleştirilir. Silindirleri teslimi olarak, cam şişeleri teknik notu insektisit ile kaplı flakon içine bırakarak, aseton buharlaşır döndürün ve. Isı d.egrade insektisit, bu nedenle ısı için kapalı olması önemlidir. Bu ısıtır ve aynı anda rulo ve aynı anahtarı ya da hot dog silindirin bağımsız ısıtma elemanı ve rulolar için anahtarları işleyen bir model kullanılarak kontrol edilir bir model üzerinde gözü kesme ya da yapılabilir. Rulo tutar daha fazla şişeleri tedavisinde kaçının; cam şişe döndürülür ve flakon duvarları düzgün bir kaplama alamayabilir önce aseton buharlaşması olabilir. Tüm aseton çekinceye kadar şişeleri döndürmek için izin verin. Belki aseton yoğunlaşma flakon duvarları ince bir tabaka vardır, bu nedenle, şişeleri tek tek incelenecek. Zaman laboratuar koşullarında dayalı şişeleri değişir rulo gereklidir. Şişeleri, kuru, kap ve ya da soğuk ve karanlık ortamlarda saklayın. Böcekler kapaklarındaki flakonun dudak (örneğin, tedavi edilen yüzeylerin kaçınarak) altında asılı konik gömlekleri veya yırtılmış folyo gömlekleri ile dinlenme gözlenmiştir; bu nedenle, un-kaplı kapaklar kullanılması önemlidir. Şişeleri hazırlamak için kullanılan herhangi bir kalan çözüm düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir. Ölçülü balona kalan çözüm Parafilm ile mühürlü ve buzdolabında saklanabilir. Farklı böcek farklı raf ömrü var, çünkü onlar hazırlanan şişeleri tarih. Örneğin, pyrethroid kaplı şişeleri, yaklaşık bir ay için iyi bir organofosfat gibi, daha istikrarsız bir insektisit ile kaplı şişeleri ise, iki hafta veya daha uzun raf ömrüne sahiptir. Sistemik İnsektisitler 2.4.2 Modifiye Yetişkin Flakon Test Floral köpük böcekler 4 insektisit çözüm sunmak için bir substrat olarak hizmet vermeye ihtiyaç vardır. Bir mantar delici kullanarak çiçek köpük (12mm x 12mm) parçalara kesin. Daha önce açıklanan cam şişe içine çiçek köpük bir parçası. 0.5 ml çözüm sunmak ve çiçek köpük üzerine dağıtmak için ayarlanabilir yinelenen pipet doldurun. Bu sıvı hacmi çiçek köpük parçasının doyurabilecek, ancak flakonda köpük seviyesini geçmemelidir. Ve yüksek konsantrasyonlarda düşük kontrolü (su solüsyonu sadece kilo bal% 10): Yine sırayla çalışır. 2.5. Depolama şişeler 2.5.1 İletişim İnsektisitler Yetişkin Flakon Test Insektisit kaplı şişeleri saklarken, insektisit özelliklerini biliyoruz. Farklı böcek gibi farklı depolama gereksinimleri vardır: piretroitler ışığa karşı duyarlıdır ve oda sıcaklığında değil, karanlıkta saklanabilir, ancak ısıya duyarlı organofosfat böcek ve bir derin dondurucuda saklanması gerekir. Böcek dondurucuda saklanabilir gerekiyorsa, bu böceklerin açığa önce oda sıcaklığına kadar ısıtılmalıdır gerekir. 2.6 Biyoassay Test edilecek böcekler toplayın. Bu süreç, feromon tuzakları,-baited süpürme ağlar, ya da başka herhangi bir kitle yakalama aracı kullanılarak yapılabilir. Bu dönemde gıda ve nem kaynağı sağlamak; Böcekler toplama işlemi sırasında yaralanmış olanlar için doğal bir ölüm meydana olanak sağlamak için 8 – 24 saat için düzenlenen olmalıdır. Büyük test edilen böceklerin sayısı, daha sağlam bir veri kümesi olacaktır; konsantrasyonu ortalama 10-25 böcekler (en az) 10 sınayın. Biyoassay böcekler seçerken, sağlıklı, aktif bireyler seçin ve uyuşuk veya anormal bireyler atın. Onlar tam konsantrasyonları ve bir seferde sadece bir konsantrasyon maruz kaldığı bu tür şişeleri yerleştirin böcekler. Bu prosedür, birinde en sağlıklı ve aktif bir birey ya da bir kaç konsantrasyonları yerleştirerek önlemek. Ayrıca, başına 10 böceklerin konsantrasyonu minimum deney yapmak mümkün değilse, her bir konsantrasyon için mümkün olduğunca çok maruz. Sonra, kısa bir süre içinde aynı örnek alan (iki-üç hafta) daha fazla böcekleri toplamak ve deney tekrarlayın. Bazı böcekler, bitki sezon ilerledikçe duyarlılık (direnç inşa) kaybedebilir; nedenle, erken bahar aylarında toplanan bireylerin yanıt, sonbaharda 28 toplanan bu farklı olabilir. Mortaliteyi değerlendirmek için ölçütler geliştirin. , Can çekişen veya ölü olarak böcekler sınıflandırmak için kullanılan en yaygın olarak kullanılan ölçüt, koordineli hareket eksikliği. Bu gözlemler, 1m veya künt bir alet ile hafifçe kışkırtılması koordineli hareket eksikliği koordine uçuş sürdürmek mümkün dorsal yüzey üzerine yerleştirilir, kendisini sağ yetersizlik içerebilir. Bireysel bir hak değil üzerine düştüğünde ise, koordineli bir hareket var; böcek ölü olarak kabul edilmelidir. Böcek kaygan bir yüzey üzerinde kendini düzeltilmesi sorunlarla karşılaşabilirsiniz; kendisi sağ için gerekli çekiş gücü elde etmek mümkün olduğunu, bu nedenle, belki de gerekli olan böcek, bir yüzey sağlamak için. Numarasını kaydedin.kurtulanlar ve her bir konsantrasyon için hayatta kalma hesaplamak için ölü bireyler. 2.6.1 İletişim İnsektisitler Yetişkin Flakon Test Böcek (ler) şişenin içine yerleştirin ve kapağı gevşek güvenli. Böcek kapağı kaçmasını önlemek gerekir, ama hava akışına izin vermek için yeterince gevşek olmalıdır. Çoğu böcek biyoanalizlere için, sadece tek bir böcek her flakonda yerleştirilir; Ancak, küçük böcekler, örneğin limonluk veya Thrips, flakon, 6, 15 ortalama olarak 30 kadar bireylerin bir oranda maruz kalabilirsiniz. Böcekler biyoassay uç noktada mortalite açısından değerlendirildi kadar oda sıcaklığında dik şişeleri yerleştirin. Pozlama süreleri, türler ve muhtemelen insektisit 3,5-27 farklılık gösterebilir . Yeni bir böcek veya kimyasal ile ilk toksik seviyeleri kurma süreci, maruz kaldıktan sonra birden fazla tarifeli zaman noktalarında nesneleri izlemek. Sınavlar yüksek hayatta kalma (<% 10 mortalite) hala olmayan insektisit tedavi kontrolü korurken yüksek konsantrasyon mortalite% 100 olduğu zaman sona erdirilebilir. % 100 ölüm kontrolü yüksek hayatta kalma ile en yüksek konsantrasyonda elde değilse, biyoassay yüksek konsantrasyonlarda bir dizi kullanarak tekrar edilmelidir. İdeal olarak, mortalite düzeyleri insektisit konsantrasyonu arttıkça artar. Bazı böcekler, 24 saat boyunca maruz kaldığında, nem kaynağı (yani, bitki materyali küçük bir parça) 12 gerektirir. Hassas bir böcek ile çalışırken, bu böcek, nem kaynağı olmaksızın yetişkin flakon test insektisit maruziyeti öncesinde flakon hayatta nasıl uzun belirlemek için faydalıdır. Bu bilgiler ile bir şişe ve bir nem kaynağı olmadan böcek yerleştirerek ve gerçek insektisit araştırmaları yapmadan önce, zaman içinde hayatta kalma izleme tarafından tespit edilebilir. 2.6.2 Modifiye Yetişkin Flakon Test Sistemik İnsektisitler Insektisit yokluğunda su çözeltisi: böcek bal ile doymuş çiçek köpük yem ve hayatta eğer biyoassay başlamadan önce belirlemek. Sadece su (veya bal:: suda çözünür olmayan teknik notu insektisit ile konsantrasyonlarının hazırlanmasında kullanılan aseton büyük miktarlarda su) çiçek köpük flakonlarda Yeri böcekler bal ile doymuş ve birkaç gün boyunca hayatta kalma izlemek. Yetişkin flakon testi Bu değişiklik sadece bir Miridae 4 ve Pentatomidae 29 ile incelenmiş olup, bu nedenle, test süresinin belirlenmesinde iletişim insektisit biyoassay için daha fazla deney gerektirir. Örneğin, Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois'da) thiamethoxam için maruz kaldıktan sonra 24 saat mortalite açısından değerlendirilir, ancak imidacloprid 4 için 72 saat . Oebalus pugax F. mortalite dinotefuran 29 maruz kaldığında 96 saatte değerlendirildi. Bu nedenle, kontrol şişelerini böcek hayatta kalma yapılabilir insektisit intoksikasyonu doğru bir ölüm derece önce birkaç gün boyunca sürekli yüksek olmalıdır. Böcek (ler), doymuş bir çiçek köpük sintilasyon şişenin içine yerleştirin. Kapaklı şişeleri sızdırmazlık yerine, bir parça pamuk ile şişeleri mühür. Böcekler mortalite açısından değerlendirildi kadar oda sıcaklığında dik şişeleri yerleştirin. Daha önce de belirtildiği gibi, düzenli aralıklarla oranı ölüm. Kontrolü yüksek hayatta kalma (<% 10 mortalite) ile en yüksek konsantrasyonda% 100 ölüm varken Sınav sona erdirilebilir. Ek konsantrasyonları test etmek için gerekli olabilir. 2.6.3 Veri Analizi Abbott 30 göre bir formül kullanarak kontrol tedavisinde mortalite için düzeltin. Düzeltilmiş ölüm oranı (%) = ((% hayatta kalma kontrolü -% sağkalım tedavi) /% hayatta kalma kontrolü) x 100 Günlük Doz probit kullanarak, nüfusun% 50 (LC 50) öldürmek ve% 95 güven aralığı (CL) kurmak için gerekli olan ölümcül konsantrasyonunu belirlemek için verileri analiz . LC 50 (PROC, değişkenler 31, Polo-Plus 32 SAS) belirlemek için birden fazla yazılım programları mevcuttur. 3. Notlar İş akışı olumsuz hava başlığı altında aseton ve böcek. Hacimsel şişeler doldururken, aseton iki yıkama şişeleri için en iyisidir. Bir yıkama şişesi, hızlı sıvılar teslimat ve yavaş teslimat için adapte edilmiştir. , Daha büyük bir açılış oluşturmak için teslim kol bölümünü kaldırın ve bu şişe, hızlı teslimat için büyük bir hacim kullanılabilir. Aseton mezuniyet hattı, değişim şişeleri yaklaşıyor ve sürülür tutarı üzerinden daha fazla denetime sahip, böylece daha yavaş teslimat ile yıkama şişesi kullanın. Mezuniyet çizgi üstü bir şişe dolu ise, üst kapalı bırakın ve aseton mezuniyet hattı için buharlaşmasına izin verir. Miktarı Not neeşişesi kaplıyorsa, konsantrasyon, yani hazırlamak için gerekli stok solüsyonu ¾ yolu ded ancak 30mls eklemek gerekir, mezuniyet hattı üzerinden gidebilirsiniz.