Биопробы для мониторинга резистентности к инсектицидам

1. Введение Производство пищевых продуктов стало чрезвычайно важное значение с осознанием того, что к 2025 году мир достигнет населения 8040 миллионов человек 1. Там будет необходимо предоставить большее количество продовольственных культур, чем в настоящее время производится. Наличие достаточных пища не будет способна без применения средств защиты растений, таких как пестициды, чтобы увеличить количество урожайности сельскохозяйственных культур и поддержания качества. На основе исторических и текущих зависимости от пестицидов, экземпляры пестицидов сопротивление будет продолжать иметь место и быть представлены в научной литературе. Вредителей устойчивости к пестицидам проблематично, потому что продукты являются неотъемлемой частью высокодоходных и высокого качества продукции сельского хозяйства. Тем не менее, злоупотребление и / или неправильное использование пестицидов может привести к развитию резистентности, которая может иметь пагубные последствия для производства сельскохозяйственных культур. Вредители (например, насекомых, сорняков, патогенов и т.д.) развивается устойчивость с помощью различных механизмов, но основным движущим фактором для развития резистентности является отсутствие зарегистрированных пестицидов 1 с независимыми способами действия доступны для использования. Когда несколько маркировки продукции для отдельных вредителей в определенной системе культуры, варианты химического контроля ограничены. Таким образом, такие же химические (ы) используется многократно и постоянное давление отбора размещается на вредителя. Эта проблема усугубляется, когда вредитель имеет несколько поколений в один год, и каждое поколение подвергается воздействию пестицидов. Есть и финансовые, и enrivornmental расходы, связанные с сопротивлением 2. Пешт сопротивления ведет к повышению ставок и более частое применение пестицидов, необходимых для достижения удовлетворительного контроля. Потери урожая могут произойти даже после увеличения использования пестицидов из-за неспособности контролировать вредителя. Пиментел 2 оценкам эти затраты пестицидов сопротивления в Соединенных Штатах составляет примерно $ 1,5 млрд в год. Обследование пестицидов восприимчивость среди популяций вредителей является проактивный подход для обнаружения любой сдвиг в инсектицид производительности и обеспечения заблаговременного предупреждения изменить стратегию химического контроля. Изменяя общие стратегии ИПМ, жизнеспособность данного пестицида может быть продлен, что, в свою очередь, имеет важное значение для сельского хозяйства и впредь оказывать достаточно пищи и волокна для всего мира. Эта статья будет описывать протокол, который может быть использован для мониторинга инсектицид восприимчивости и обнаружить развитие устойчивых к инсектицидам групп населения, используя взрослых пробирку 3 для контактных инсектицидов и модификации этого теста на заводе системные инсектициды 4. 2. Методы 2,1 безопасности Заявление Использование надлежащих мер предосторожности очень важно при работе с инсектицидами. Проконсультируйтесь с данными по безопасности материалов (MSDS) для принятия соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ) перед работой с пестицидами. Специальная подготовка лаборатории по обработке пестицидами в лаборатории должны быть необходимые персонала, прежде чем пытаться любой биопробы. 2.2 Создание исходного раствора Разработка исходного раствора известной концентрации от источника инсектицид активного ингредиента (AI). Все желаемой концентрации включены в качестве лечения в биопроб будут сделаны из оригинального исходного раствора. Для интереса этой статьи, 100mls от 100 мкг / мл раствора будет развиваться как маточный раствор, однако, любой концентрации может быть разбавлен с этой исходной концентрации. Настраивает количество технического ИИ класса следует оценивать на основе процентной чистоты. Сумма, подлежащая весил = (объем сделать) Х ([# мкг / мл] / [% purity/100]) Например, это потребует 10152.284 мкг технического ИИ, чтобы сделать 100 мл 100 мкг / мл раствора инсектицида технических степени 98,5% чистоты: (100 мл) Х ([100μg/ml] / 0,985) = 10152,284 мкг 2.2.1 взрослых флакон тест для контактными инсектицидами Частично заполнить мерную колбу с ацетоном и весят регулировать количество инсектицида AI. Промыть вес лодки с ацетоном в колбу, чтобы удалить все инсектицид из весят лодке. Заполните мерную колбу на выпуск линии с помощью ацетона. Большинство решений состоявшегося в холодильнике будет поддерживать деятельность без заметного снижения эффективности в течение приблизительно одного месяца. 2.2.2 Модификация взрослых пробирку для системных инсектицидов Интоксикация насекомых с системными инсектицидами заметно отличается от этого контакта продуктов. Системные продукты как правило, должны поступать в организм насекомого, чтобы стать активными, а не насекомых, имеющих прямое exposurе продукт как с контактными инсектицидами. Таким образом, взрослый тест флакон был изменен для того, чтобы системные инсектициды для тестирования. Вес А. И. необходимые для маточного раствора рассчитывается аналогично, которые упомянуты в разделе 2.2. Методология аналогична, за исключением А. И. растворяют в 10% по весу меда: водный раствор. Это решение должно быть принято в течение 24 часов после начала биопроб. Если технический сорт материала не растворимые в воде, высокой концентрацией инсектицида решение может быть сделано с помощью ацетона, так что только небольшой объем инсектицида: ацетон добавляют мед: водный раствор 4. 2,3 Определение диапазоне концентраций и развитие концентрации Определение соответствующих концентрациях, необходимых для создания диапазон ответов для биопроб может быть затруднено. Несколько репликации могут быть необходимы для определения диапазона концентраций, и это делается методом проб и ошибок. Кроме того, диапазон может изменяться с течением времени, если население изменения уровня восприимчивости. Многие другие факторы следует учитывать при установлении окончательной концентрации и включают в себя: семейство насекомых, класс инсектицидов, размер насекомого, и т.д. Ранее были опубликованы результаты тестов взрослых флакона может помочь с изначального выбора инсектицида концентрациях. Биопробы были опубликованы для: Hemiptera: Aleyrodiidae 5-6, Aphididae 7, Pentatomidae 8-10 и 11-14 Miridae; Thysanaptera: Thripidae 15; Coleoptera: Brentidae 16, Curculionidae 17, 18-19 и Coccinellidae Cybocephalidae 19; Diptera: Culicidae 20; Lepidoptera: листоверток 21 и 3 совок, 22-26; Hymenoptera: Braconidae 7,18, Ichneumonidae 26-27, Aphidiidae 18, Encyrtidae 7 и Aphelinidae 18. Концентрации принимаются на основе «Х» мкг / мл. Однако, когда флаконы готовят к взрослой пробирку, только 0,5 мл будет добавлен в каждом флаконе, поэтому концентрация флакон наполовину концентрация сделаны. Как только концентрация выбраны, следующее уравнение может помочь в определении количества раствора добавлены, чтобы сделать нужной концентрации. (С1) (V1) = (C2) (V2) Где С1 концентрации исходного раствора; V1 является объем биржевых необходимы, чтобы сделать новый концентрации; С2 концентрации в стадии разработки; и V2-объем новых концентрации. Например, 5mls из 100μg/ml маточного раствора необходимо, чтобы сделать из 100mls 5μg/ml. Это 5μg/ml решение привело бы во флаконах покрытием при концентрации 2.5μg/vial. 5mls = [(5μg/ml) (100mls)] / (100μg/ml) 2.3.1 взрослых флакон тест для контактными инсектицидами Частично заполнить объемный flaks, и аликвоту расчетного количества исходного раствора необходимо сделать нужной концентрации. Заполните мерную колбу с ацетоном окончания строки и перейдите к разделу 2.4 или печать с парафильмом М (Alcan Inc, Нина, штат Висконсин) для хранения в холодильнике для последующего использования. Большинство решений хороши на 1 месяц. 2.3.2 Модификация взрослых пробирку для системных инсектицидов Этот процесс так же, как уже упоминалось в разделе 2.3.1, за исключением 10% по весу меда: водный раствор заменяется ацетоном. Смешайте мед достаточно: водный раствор, чтобы сделать все необходимые концентрации. Эти решения должны быть использованы в течение 24 часов после его приготовления. 2,4 Подготовка Флаконы 2.4.1 взрослых флакон тест для контактными инсектицидами Если концентрации были храниться в холодильнике, позволяют нагреться до температуры окружающей среды. Объем ацетона изменения в зависимости от температуры, которые могут повлиять инсектицид концентрации. Цветовой код 20 мл стеклянных флаконах (установленный для винтовых колпачков) для концентраций с использованием краски или маркерами. Отрегулируйте повторять дозаторов для доставки 0.5ml/concentration. Начало работы с ацетоном контроля, следующий с низкой концентрацией и продолжается с увеличением концентрации пока все концентрации были использованы. Налейте примерно половину объема раствора, как фактическое количество флаконов лечиться (то есть, 20mls на 40 флаконов) в небольшой стакан. Когда раствор не используется, закройте его, чтобы минимизировать испарения, которые могут вызвать изменения в концентрации. Ничья в раствор инсектицида повторять пипетки и обойтись 0,5 мл раствора в отдельных стеклянных флаконах. Сразу после лечения, стеклянные пузырьки размещаются на коммерческой горячим роликом собаки. Как свою очередь, ролики, стеклянные флаконы вращать и ацетон испаряется, оставляя внутри флакона покрыты техническими инсектицид класса. Тепло может гegrade инсектицид, поэтому важно, чтобы тепло быть выключен. Это может быть сделано либо путем отключения нагревательного элемента на модели, которая нагревает и рулонов одновременно и находится под контролем того же коммутатора или с помощью модели горячим роликом собака, которая самостоятельно функционирует переключатели для нагревательного элемента и роликов. Избегайте лечения более чем флаконы ролик имеет место; ацетон может испариться, прежде чем стеклянные флаконы вращаются, и они не могут получить даже покрытие на стенах флакона. Разрешить флаконах вращаться, пока все ацетон испарился. Там, может быть, тонким слоем ацетона конденсата на стенах флакона, поэтому флаконы должны быть рассмотрены в индивидуальном порядке. Время, необходимое для рулона флаконах изменяется в зависимости от лабораторных условиях. Как только флаконы сухие, кепке и хранить их либо в охлажденном или темных условиях. Насекомые были замечены опираясь на крышки с коническими вкладышами или порванные лайнеров фольги, которые висят под губу флакон (то есть, избегая обрабатываемой поверхности), поэтому важно использовать ООН подкладке крышки. Любой оставшийся раствор не используется для подготовки флаконов следует утилизировать должным образом. Решение остаться в мерную колбу можно уплотнять парафильмом и хранить в холодильнике. Дата флаконах, когда они готовы, потому что различные инсектициды разные жизни полке. Например, пиретроид покрытием флаконах хорошо в течение приблизительно одного месяца, тогда как флаконы покрыты более нестабильной инсектицид, как и фосфорорганических, есть полки жизни двух недель или менее. 2.4.2 модифицированный тест взрослых флакон для системных инсектицидов Цветочные пены необходимо, чтобы служить в качестве субстрата для доставки раствор инсектицида для насекомых 4. Вырезать цветочные пены (12 мм Х 12 мм) части, используя пробку буром. Разместите один кусок цветочные пены в стеклянных флаконах описано выше. Заполните повторять пипетка скорректированы для доставки 0,5 мл раствора и обойтись на цветочной пены. Этот объем жидкости должен насытить часть цветочной пены, но не должна превышать уровень пены в флаконе. Снова работа в последовательности из-под контроля (10% по весу меда: водный раствор только) и самой низкой до самой высокой концентрации. 2.5. Хранение Флаконы 2.5.1 взрослых флакон тест для контактными инсектицидами При хранении инсектицид покрытием флаконы, знать свойства инсектицида. Различные инсектициды имеют разные требования хранения данных, такие как: пиретроиды являются светочувствительными и может храниться при комнатной температуре, но в темноте, однако, фосфорорганические инсектициды чувствительны к перепадам температур, и их необходимо хранить в морозильной камере. Если инсектициды должны храниться в морозильнике, то они должны быть прогреты до комнатной температуры, прежде чем подвергать насекомых. 2,6 биопроб Сбор насекомых для тестирования. Этот процесс может быть сделано с помощью феромонов наживкой ловушки, размах сети, или любых других средств массового захвата. Насекомые должны быть проведены в течение 8-24ч для обеспечения естественной смертности происходят пострадавшим во время процесса сбора, обеспечивают их продуктами питания и влаги источника в этот период. Испытание 10-25 насекомых в концентрации (10 минимум); большее количество насекомых испытания, более надежный набор данных будет. При выборе насекомых для биопроб, выберите здоровых, активных людей и выбросить вялыми или ненормальных людей. Место насекомых в флаконах, что они подвергаются полный спектр концентраций, а не только одной концентрации в то время. Эта процедура позволит предотвратить размещение самых здоровых и активных людей в одном или нескольких концентраций. Кроме того, если это не возможно провести эксперимент с минимум 10 насекомых в концентрации, выставить как можно больше для каждой концентрации. Затем собрать больше насекомых из той же области образца в течение короткого времени (две-три недели) и повторить эксперимент. Некоторые насекомые могут потерять чувствительность (сборка сопротивления), как прогрессирует сезоне урожай, поэтому реакция людей, собранных в начале весны могут отличаться от тех, собранные осенью 28. Разработка критериев для оценки смертности. Наиболее часто используемые критерии, используемые для классификации насекомых, умирающих или умерших отсутствие скоординированного движения. Эти наблюдения могут включать неспособность самого права, если их поместить на его спинной поверхности, не в состоянии поддерживать скоординированное полет 1м или отсутствие скоординированного движения при легком ткнул тупым предметом. Если человек может само право, но падает, нет скоординированного движения; насекомого следует считать мертвым. Насекомого могут испытывать трудности восстанавливающее себя на гладкой поверхности, поэтому, возможно, необходимо обеспечить насекомых поверхности так, чтобы он смог получить тягу необходимо само право. Запись числавыживших и умерших лиц для расчета выживаемости для каждой концентрации. 2.6.1 взрослых флакон тест для контактными инсектицидами Место насекомых (ы) в пузырек и безопасный колпачок свободно. Крышка должна предотвратить насекомых убежать, но быть достаточно свободной, чтобы поток воздуха. Для большинства насекомых биопробы, только одно насекомое находится в каждом флаконе, однако, мелких насекомых, например, белокрылки и трипсов, могут подвергаться в размере как минимум 30 особей на флакон 6, 15. Место флаконы вертикально при комнатной температуре до насекомых оцениваются на смертность в конечной точке биопроб. Выдержки раз может отличаться с видами и, возможно, инсектицид 3,5-27. В процессе создания начального уровня токсичности новых насекомых или химические, контролировать предметы в нескольких запланированных временных точках после заражения. Экзамены могут быть прекращены, когда смертность в наибольшей концентрацией на 100% при сохранении высокой выживаемости (<10% смертность) в не обработанных инсектицидом контроля. Если 100% смертность не будет достигнут на самых высоких концентраций с высокой выживаемости в контрольных, биопроб следует повторить с использованием целого ряда более высоких концентрациях. В идеале, уровни смертности должна возрастать по мере увеличения концентрации инсектицида. Некоторые насекомые, при воздействии в течение 24 часов, требуют источник влаги (например, небольшой кусочек растительного материала) 12. При работе с тонким насекомых, это выгодно, чтобы определить, как долго насекомых могут выжить в пузырек без источника влаги до инсектицидов воздействия на взрослого пробирку. Эта информация может быть определена путем размещения насекомое в флакон с и без влаги источника и контроля за его выживание в течение долгого времени, прежде чем проводить исследования фактических инсектицида. 2.6.2 модифицированный тест флакон для взрослых Системные Инсектициды До начала биопроб, определить, если насекомое может кормить и выжить на цветочной пены насыщенной медом: водный раствор при отсутствии инсектицида. Место насекомых во флаконах с цветочной пены насыщенной с медом: только вода (или мед: вода с большим объемом ацетона, использованные при подготовке концентраций с не-растворимые в воде технических инсектицид класса) и монитор выживаемости в течение нескольких дней. Эта модификация взрослых пробирку только были рассмотрены с Miridae 4 и Pentatomidae 29, поэтому определяющим продолжительность испытания требует больше экспериментов, чем для биопроб инсектицид контакта. Например, Lygus lineolaris (Palisot де Бовуа) была оценена на смертность в течение 24 часов после воздействия тиаметоксам, но в течение 72 часов имидаклоприд 4. Смертность Oebalus pugax F. был оценен в 96 часов под воздействием dinotefuran 29. Таким образом, насекомое выживаемости в контрольных флаконы должны быть стабильно высоким в течение нескольких дней до точной рейтинге смертности от инсектицидов интоксикации могут быть сделаны. Место насекомых (ы) в сцинтилляционный флакон с насыщенным цветочным пены. Вместо того, чтобы уплотнения флаконов с крышками, печать флаконах с ватным тампоном. Место флаконы вертикально при комнатной температуре до насекомых оцениваются на смертность. Как упоминалось ранее, уровень смертности на регулярной основе. Экспертиза может быть прекращено при наличии 100% смертности в наибольшей концентрации с высокой выживаемости (<10% смертность) в элементе управления. Это может быть необходимо для проверки дополнительной концентрации. 2.6.3 Анализ данных Правильный код для смертность в контрольной лечение с использованием формулы в соответствии с Abbott 30. Исправлено смертности (%) = ((контроль% выживания – выживания% лечение) /% выживаемости контроля) х 100 Анализ данных с использованием пробит Вход Доза для определения летальной концентрации, не дождавшись ответа 50% населения (LC 50) и установить 95% доверительный интервал (CL). Много программ для определения того ЛК 50 (SAS: PROC пробит 31, Поло-Плюс 32). 3. Примечания Работа с ацетоном и инсектициды под отрицательным потоком воздуха капотом. При заполнении мерные колбы, то лучше иметь два мыть бутылки ацетона. Один вымыть бутылку, которая была приспособлена для быстрой доставки жидкостей и один для медленной доставки. Удалите часть доставки руку, чтобы создать большее открытие и эта бутылка может быть использована для доставки больших объемов быстро. Как только ацетон приближается к окончанию строки перейдите бутылки и использовать вымыть бутылку с медленной доставки, чтобы иметь больше контроля над сумма, которую разливают. Если колба заполнена выше окончания линии, оставьте довершение и позволяют ацетона испариться до окончания линии. Обратите внимание на количество урожденнойДед из маточного раствора, необходимые для подготовки концентрации, т. е., если вы заполните колбу ¾ путь, но нужно добавить 30 мл, вы можете перейти окончания линии.