Yetişkin Zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon
Summary
Biz yetişkin zebrafish intraperitoneal göstermektedir. Biz bir Micro4 denetleyicisi ve UltraMicroPump III tarafından kontrol edilen bir 10 ul NanoFil mikroenjektör kullanın. Bu gösteri, bir anestezik olarak soğuk su kullanımını içerir.
Abstract
Kimyasal zebrafish tedavi için uygun bir yöntem balık tarafından ele alınacak tank su, reaktif tanıtmak. Ancak, bu yöntem reaktif emilir veya balık başına ne kadar zor biliyor yapar. Metabolik çalışmalar özellikle de ilgili bazı deneysel sorular, ağırlığına göre her bir balık için belirli bir miktar sunarak daha iyi ele alınabilir. Burada yetişkin zebrafish içine intraperitoneal (IP) enjeksiyon için bir yöntem mevcut. Enjeksiyon, karın boşluğuna pelvis posterior. Bu prosedür, büyük balıklar için kullanılan veteriner yöntemler uyarlanmıştır. Biz sıfır mortalite gibi, güvenli. Ayrıca, 127 enjeksiyonlar sadece 5 enjeksiyon yerinde kanama, kanama ve bu vakaların her biri, kısa süreli, kalıcı birkaç saniye idi ve kan kaybı miktarı küçüktü. Bu yordamı ile Başarı, anestezi, enjeksiyon ve kurtarma ağırlığında, oruç da dahil olmak üzere birkaç adım ile balık nazik işleme gerektirir. Önlemler prosedür boyunca stresi en aza indirmek için gereklidir. Önlemler küçük bir enjeksiyon hacmi ve 35G iğne ile içerir. Biz Cortland tuz çözeltisi ozmotik tatlı su balıkları için dengeli bir araç olarak kullanırlar. Solungaçları Havalandırma, enjeksiyon sırasında suya doymuş bir sünger içinde bir çukur balık tutarak, yavaş operculum'un hareketleri sağlayan bir cerrahi anestezi uçak, ilk balık getirerek enjeksiyon işlemi sırasında tutulur ve ikinci sırada yer alıyor. Biz, şekeri enjekte ve kan glikoz düzeyi yükselmeye ve normal bir sonraki geri izleme IP enjeksiyon yararını göstermektedir. Stres, teleost balık kan şekeri artırmak için ve Bilindiği gibi, araç-enjekte ve non-enjekte yetişkinlerde kan şekeri düzeylerini karşılaştırmak ve yordam kan şekeri önemli bir artışa neden olmadığını göstermektedir.
Protocol
Discussion
Intraperitoneal beş adımları içerir:, açlık, tartma,, enjeksiyon ve kurtarma anestezi. Her adım için en iyi uygulamaların başarıya ulaşmasını sağlamak olabilir vardır. Başarı, sağlıklı bir balık hasta yanı sıra iyi bir deneysel sonuç içerir.
Oruç: 24-saatlik hızlı bağırsak ampul boşaltmak gerekir. Bu uygulama balık veteriner edebiyatı (örneğin, Brown 1993) alınmıştır. Ek açlık hususlar aşağıda tartışılmıştır.
Uzun vadeli oruç: Biz bir 72 saatlik hızlı enjeksiyondan önce temel düzeyde kan şekeri azaltmak için gerekli olduğunu bulduk (Eames ve ark, 2010). Ayrıca glikoz çalışmalar için balık düzgün oruç tuttuklarını olduğundan emin olmak için gerekli olan çok sayıda prosedür olduğunu bulduk. (Alt kısmında hiçbir enkaz) temiz bir tank ile başlayın. Tanklar açıkça 'açlık' olarak etiketlenmiş, çevrimdışı olmalıdır ve bir yerde coşkulu balık bakım personeli onları beslemek olmaz. Tankın dış çevre değerlendirin ve stres, kan şekeri (Chavin ve Young, 1970; Groff ve ark, 1999) yükseltmek için bilindiği gibi bozuklukları vurguladı olan balık önlemek için adımlar atması . Örneğin, bir radyo, her gün balık tankları tutuyordu bankta ameliyat edildi açlık deney vardı. Biz kan şekeri alışılmadık derecede yüksek olduğu ve balık titreşimler tarafından vurgulandı olduğu sonucuna varıldı bulundu. Başka bir stres aşırı kalabalık. Balık, iyi balık yetiştiriciliği uygulamaları ile uyumlu bir yoğunluk tutulmalıdır. Öneriler için, bkz. Brand ve ark . (2002) ve Westerfield (1995). Biz, 9 litrelik tank (3 kat mermerler bu hacim kaplıyor ile) 10-12 balık bir yoğunlukta balık açlık iyi sonuçlar oldu. Cinsiyetlerin ayrılması strese neden olabilir, bu yüzden hızlı sırasında seks karışık bir nüfusu korumak öneririz. Bu yumurta döşenebilir anlamına gelir ve yumurta yedikleri olmayacak böylece sekestre gerekir. Yumurta ayırmak için basit bir yolu, 2-3 kat mermer ile tank alt kapağı. Su kalitesi, yumurta ve atık kaldırma ve günlük yaklaşık% 10-15, tank suyu değiştirerek bakıma ihtiyacı vardır. Sifon, yumurta ve atık çıkarmak için iyi çalışır.
Tartım: anestezi değil balık tartım, hassas tartım sağlamak için, beher içine net su transferi en aza indirmek için alınması olmalıdır. Net (balık), kağıt havlu, lekelenen ise, aşırı su çoğunluğu kaldırılmış olabilir ve ağırlığını doğru olarak ölçülebilir. Önce ağırlığında balık uyutmak için daha kolay olabilir, ama biz bir gün içinde iki kez balık anestezi olası etkileri test etmedim. Biz anestezi yapıldıktan sonra yeniden ağırlığında balık daha sonra file / blot yöntemi ile ilk balık ağırlığında bizim teknik test ve hafifçe kuru lekelenen. Ağırlık yöntemleri arasında anlamlı bir fark bulundu (P = 0,7927, t-testi). Ayrıca, biz bu file / (yok blot) düşülmektedir gibi sadece en kısa sürede beher balık transferi ile karşılaştırıldığında, blot yöntemi etkilenen kan şekeri olmadığını test etti. Biz iki transfer yöntemleri arasında kan glikoz düzeyi açısından anlamlı bir fark bulundu (P = 0,2241, t-testi).
Anestezi: Kimyasal anestezi birçok çalışmalar için uygun olabilir. Burada birçok anesteziklerin (tricaine/MS-222 (Brown, 1993) dahil), kan şekeri yükseltmek için, alternatif olarak soğuk su anestezi göstermiştir. Daha önceki çalışmalarda, soğuk su kan şekeri (Eames ve ark, 2010) zebrafish yükseltmek değil yaptığı tespit ettik.
Soğuk su anestezi için, sıcaklık yavaş yavaş azaltılmalıdır. Düşüş oranı, küçük balık büyük balık daha hızlı altında gidiyor, balığın büyüklüğüne bağlı görünüyor. Enjeksiyonu takiben, balık (aşağıya bakın) anestezi çok yavaş iyileşmekte olduğunu gözlemleyebiliriz. Başlangıç sıcaklığı sıcaklığı çok hızlı bir şekilde azalmıştır çok düşük, ya da zaman zaman da yol açabilir. Başlangıç sıcaklığı suya girdikten sonra eğer yanal balık virajlarda çok düşük. Başlangıç sıcaklığı doğruysa, balık başlangıçta dengesini koruyacaktır. Pektoral yüzgeçler, yatay konumda döndürmek gasp ve hızlı operculum'un hareketleri var. Genellikle, yüzmek. Sıcaklık düştükçe, hareketleri azalacak ve balık denge kaybedersiniz. Balık tepki olmadan işlenebilir bir cerrahi anestezi düzlemine ulaşılır. Cerrahi anestezi altında balık korumak için, parmaklarınızı, soğuk olabilir, bu yüzden balık işleme önce su tutmak gerekir. Sünger balık anestezi için kullanılan suyun aynı sıcaklıkta soğuk muhafaza edilmelidir. Sufficie su ile sünger doyurmak için önemlidir.balık üzerine konulduğunda anesteziyi idame ettirmek için ntly soğuk.
Enjeksiyon: üstlenen enjeksiyonları öncesinde, vücut duvar kalınlığı bir anlamda almak için en az bir balık incelemek isteyebilirsiniz. Bu karın boşluğuna girmek için iğne eklemek için ne kadar ihtiyacı yargılamak için yardımcı olabilir. Ayrıca, iğneyi, iğne karın boşluğuna girdiğinde vücut duvarı "vermek" hissedebilirsiniz. Enjeksiyon sırasında, hasta mutlu etmek için adımlar atın. Sünger enjeksiyon sırasında canlandırılması balık önlemek için doğru sıcaklık soğuk su ile doymuş olduğundan emin olun. Iyi doymuş ve yumuşak bir sünger, ölçekler ve cildi kaplayan mukus zarar en aza indirmek için önemlidir. İyi doymuş sünger solungaçları gazlı tutmak için de önemlidir. Biz çok Malzemeleri altında aşağıda listelenmiştir köpük sünger tavsiye ederiz. Son olarak, bir kez balık anestezi, balık altında olduğu zaman en aza indirmek için hızlı çalışır.
Kurtarma: balık hemen hemen sıcak bir tankın su girdikten sonra anestezi kurtarmak gerekir. Balık kurtarma hız solungaçları doğru girdap su yavaşça hemen yüzme başlamazsa. Eğer toparlanmanın yavaş, sonra balık çok çabuk altında gitti ve uygun anestezi prosedürü ayarlamanız gerekir. Anestezi altında yavaş toparlanma olası nedenleri tartışılmıştır.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı Hibe 5-2007-97 (VEP), Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen hibe R01DK064973 (VEP), R01DK48494 (LHP), T32DK07074 (SCE destekleyen), K01DK083552 (MDK) ve Chicago Üniversitesi Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi için P60DK20595 tarafından. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIDDK veya NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Foam Sponge | Jaece Industries | L800-D | ||
| 60 mm Petri dish | ||||
| Pipet tip box lid | not too deep, e.g. 1.5 cm | |||
| Plastic storage container | deep, e.g. 7 cm | |||
| Thermometer | ||||
| Crushed ice | made from facility water | |||
| Warm facility water | 1 liter or more | |||
| 500 ml beaker | for weighing | |||
| NanoFil syringe | World Precision Instruments (WPI) | NANOFIL | or Hamilton syringe | |
| 35 gauge needle | WPI | NF35BV-2 | beveled | |
| Silflex tubing | WPI | SILFLEX-2 | ||
| UltraMicroPump III and Micro4 controller | WPI | UMPS-1 | ||
| Foot switch | WPI | 15867 | ||
| Dissecting microscope | ||||
| Plastic wrap | ||||
| Paper towels | ||||
| Cortland salt solution |
Referências
- Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G., Hoar, W. S., Randall, D. J. Perfusion methods for the study of gill physiology. Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water. , 325-388 (1984).
- Brown, L. A., Stoskopf, M. K. Anesthesia and restraint. Fish Medicine. , 79-90 (1993).
- Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Chavin, W., Young, J. E. Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L. Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).
- Groff, J. M., Zinkl, J. G. Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-37 (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (1995).
- Iwama, G. K., Ackerman, P. A., Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. Anaesthetics. Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques. , 1-15 (1994).
- Reavill, D. R. Common diagnostic and clinical techniques for fish. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).
- Stoskopf, M. K., Stoskopf, M. K. Surgery. Fish Medicine. , 91-97 (1993).
