慢性成像小鼠的视觉皮层使用减薄，颅骨的制备
Summary
我们在这个视频和补充材料，表现出对慢性协议<em>在体内</em>完好使用一个头骨变薄，准备的脑成像。
Abstract
在体内成像，利用双光子激光扫描显微镜（2PLSM）允许在完好的大脑活体细胞和神经元突起的研究。这里介绍的技术，允许在几个时间点与微观的决议，允许这是代表多数在中枢神经系统的兴奋性突触后网站的一小结构的树突棘的跟踪（慢性成像）的大脑同一区域的成像。能够清楚地解决以上几个时间点的优良的皮质结构有很多优点，特别是在大脑的可塑性，在突触和电路重塑的形态学变化可能有助于解释底层机制的研究。在这个视频和补充材料，我们将展示一个长期在体内的完整使用一个头骨变薄，准备的脑成像协议。薄头骨准备是一种微创的方法，从而避免了潜在损害的硬脑膜和/或皮质，从而减轻炎症反应的发生。当执行这个协议是正确的，它可以清楚地监测树突棘的特点，在经过一段时间的长期完整的大脑变化。
Protocol
要完整的使用双光子显微镜，一个神经元与荧光标记物标记的准备的大脑中的神经元可视化使用。这里介绍在实验中，我们使用的GFP – M的转基因小鼠线，标签5层的锥体细胞。 5层的锥体细胞投射到表层的树突状进程，使树突和树突棘的可视化深度为300微米以下的PIA水平。另一种方法是使用病毒标志物（见洛厄等 。提交给朱庇特）标签细胞。 消毒工作区，使用70％的乙醇和高压灭菌器工具，无菌…
Discussion
慢性成像，利用双光子显微镜技术正成为一个日益流行的技术，研究过程中的可塑性2-5引发的形态学变化。在这里，我们展示了一个薄的头骨的准备工作，按照不同的成像天在完整的小鼠大脑中确定的树突棘。在这个协议中，头骨是原封不动的，造成最小损害的皮质和neuroinflammation非常低的水平，这可能会改变大脑功能6。这使得动物成像后，立即在第一次手术，然后随后重新制作…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由宝来惠康（AKM）在生物医学科学事业奖，白厅基金研究资助（AKM），斯隆基金会奖学金（AKM），美国国立卫生研究院EY019277（AKM），和聂资助，视力训练补助金，EY013319（ EAK）。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fentanyl Citrate | In-house pharmacy | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
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| Medetomindine Hydrochloride | In-house pharmacy | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
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| Midazolam HCL | In-house pharmacy | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
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| 2,2,2-tribromoethanol | Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1% |
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| 2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%) | Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775% |
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| TC-1000 Temp. Control System for Mice | CWE, Inc. | TC-1000 Mouse | Body Temp. Regulation | |
| Toberadex | In-house pharmacy | Eye Ointment | ||
| 10% Ferric Chloride | Ricca Chemical, Inc. | 3120-32 | Thin-skull preparation | |
| Microsurgical Blade | Sable Industries | S-6400 | Thin-skull preparation | |
| Cyanoacrylate 404,401 | Loctite | P/N 46551 | Thin-skull preparation | |
| Cyanoacrylate 401 | Loctite | P/N 40140 | Thin-skull preparation | |
| Zip Kicker Glue Accelerator | Pacer Technology | PT-29 | Thin-skull preparation | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | Thin-skull preparation | |
| Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Thin-skull preparation | |
| #6-0 (0.7 metric ) silk suture | Ethicon | K8894H | Taper C-1 | |
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11000-12 |
Referências
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo. J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Xu, H. T. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
Tags
Chronic ImagingMouse Visual CortexThinned-skull PreparationIn Vivo ImagingTwo-photon Laser Scanning MicroscopyLiving CellsNeuronal ProcessesIntact BrainDendritic SpinesPostsynaptic Excitatory SitesCNSBrain PlasticitySynapsesCircuit RemodelingFine Cortical StructuresProtocolMinimally Invasive Approach
Citar este artigo
Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation. J. Vis. Exp. (44), e2060, doi:10.3791/2060 (2010).