प्राइमर - फ्री aptamer चयन एक यादृच्छिक डीएनए लाइब्रेरी का उपयोग
1Department of Pathology, Hershey Medical Center,Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry,Pennsylvania State University, 3Departments of Pathology, and Biochemistry and Molecular Biology, Hershey Medical Center,Pennsylvania State University, 4Materials Research Institute,Pennsylvania State University
Summary
SELEX प्रोटोकॉल चयन के कई दौर है, जिनमें से प्रत्येक बाध्य ligands, जो बारी में तय प्राइमर यादृच्छिक पुस्तकालय क्षेत्रों flanking दृश्यों की आवश्यकता के उत्थान की आवश्यकता शामिल हैं. ये तय प्राइमर दृश्यों चयन प्रक्रिया (झूठी सकारात्मक और नकारात्मक) के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. यहाँ हम एक किताब मुक्त प्रोटोकॉल उपस्थित थे.
Abstract
Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified through an in vitro selection process called Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) to recognize a wide variety of targets, from small molecules to proteins and other macromolecules 2-4. Aptamers have properties that are well suited for in vivo diagnostic and/or therapeutic applications: Besides good specificity and affinity, they are easily synthesized, survive more rigorous processing conditions, they are poorly immunogenic, and their relatively small size can result in facile penetration of tissues.
Aptamers that are identified through the standard SELEX process usually comprise ~80 nucleotides (nt), since they are typically selected from nucleic acid libraries with ~40 nt long randomized regions plus fixed primer sites of ~20 nt on each side. The fixed primer sequences thus can comprise nearly ~50% of the library sequences, and therefore may positively or negatively compromise identification of aptamers in the selection process 3, although bioinformatics approaches suggest that the fixed sequences do not contribute significantly to aptamer structure after selection 5. To address these potential problems, primer sequences have been blocked by complementary oligonucleotides or switched to different sequences midway during the rounds of SELEX 6, or they have been trimmed to 6-9 nt 7, 8. Wen and Gray 9 designed a primer-free genomic SELEX method, in which the primer sequences were completely removed from the library before selection and were then regenerated to allow amplification of the selected genomic fragments. However, to employ the technique, a unique genomic library has to be constructed, which possesses limited diversity, and regeneration after rounds of selection relies on a linear reamplification step. Alternatively, efforts to circumvent problems caused by fixed primer sequences using high efficiency partitioning are met with problems regarding PCR amplification 10.
We have developed a primer-free (PF) selection method that significantly simplifies SELEX procedures and effectively eliminates primer-interference problems 11, 12. The protocols work in a straightforward manner. The central random region of the library is purified without extraneous flanking sequences and is bound to a suitable target (for example to a purified protein or complex mixtures such as cell lines). Then the bound sequences are obtained, reunited with flanking sequences, and re-amplified to generate selected sub-libraries. As an example, here we selected aptamers to S100B, a protein marker for melanoma. Binding assays showed Kd s in the 10-7 – 10-8 M range after a few rounds of selection, and we demonstrate that the aptamers function effectively in a sandwich binding format.
Protocol
1. प्राइमर मुक्त चयन प्रोटोकॉल का संक्षिप्त विवरण एक डबल असहाय डीएनए पुस्तकालय इसी (Figure1 और 2, एक कदम) oligonucleotides, जो NT के 30 के एक केंद्रीय यादृच्छिक डोमेन शामिल दो प्राइमर क्षेत्रों द्वारा flanked के साथ पीसीआर का उपयोग निर्माण किया गया. दो थोड़ा अलग "प्राइमर मुक्त" (पीएफ) प्रोटोकॉल विकसित किया गया. DsDNA लायब्रेरी में, क्षेत्र 5'एक endonuclease endonuclease Nt.BstNBI के लिए "nicking" साइट शामिल हैं, इस एंजाइम dsDNA पहचानता है, लेकिन केवल एक कतरा डीएनए सब्सट्रेट के cleaves. DsDNA पुस्तकालय के क्षेत्र 3'endonuclease Nt.BbvCI के लिए एक "nicking" साइट है, भी है कि dsDNA पहचानता है, लेकिन केवल एक कतरा cleaves, 3'end (1 पीएफ), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक BspMI में एक सीसी छोड़ने शामिल endonuclease प्रतिबंध साइट है, जो दोनों किस्में cleaves कोई अतिरिक्त 3 'nucleotides (2 पीएफ) को छोड़कर . हम आम तौर पर पीएफ 1 प्रोटोकॉल शुरू रोजगार (क्योंकि इसकी अलग चयन प्रक्रिया के दौरान उत्पादित टुकड़े के लिए आसान है, नीचे देखें), और तब चयन के बाद के दौर के लिए पीएफ 2 प्रोटोकॉल को रोजगार. 32 5'-pN30 – सीसी-3 (32 + टुकड़ा नामित) टुकड़ा और 30 5'-pN30-3 NT के 'टुकड़ा (30 + टुकड़ा नामित) के NT के क्रमशः Nt.BbvCI / NT द्वारा उत्पन्न किया गया BstNBI या dsDNA पुस्तकालय के दरार / BspMI Nt.BstNBI, और जेल शुद्धि. 32 + टुकड़ा 3'अंत में एक सीसी flanking अनुक्रम (1 पीएफ) के साथ 30 NT के यादृच्छिक डोमेन, शामिल हैं . 30 टुकड़ा + (2 पीएफ) केवल 30 NT के यादृच्छिक डोमेन अनुक्रम होते हैं. "आत्म पुल" 66 – टुकड़ा (5 'और 3' flanking दृश्यों के साथ यादृच्छिक N30 क्षेत्र युक्त) जेल शुद्धि (Nt.BbvCI या Nt.BstNBI केवल ऊपरी "+" कतरा कटौती) के द्वारा प्राप्त किया गया था. यह आत्म पुल सीधे पीएफ एक प्रोटोकॉल में प्राप्त है, या उत्पन्न किया जा सकता है और साथ ही NtBbv.CI या Nt.BstNBI पीएफ 2 प्रोटोकॉल (चित्र 1 और 2, चरण ख) के लिए पुस्तकालय डीएनए काटने के बाद अलग है. 32 + – या 32 + – टुकड़े शुट्ठ प्रोटीन या सुसंस्कृत मेलेनोमा कोशिकाओं के साथ incubated रहे थे टुकड़े प्रोटीन या कक्षों के लिए बाध्य करने के लिए अनुमति देते हैं, और तब अनबाउंड टुकड़े धुल गया (चित्रा 1 और 2, चरण ग). बाउंड या चयनित टुकड़े प्राइमर क्षेत्रों के पुनः पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया गया. प्रतिक्रिया / संकरण ligation, आत्म पुल का उत्पादन किया गया था और 32 के रूप में एक ही समय में शुद्ध + – और 30 + टुकड़ा शुद्धि, 5'-अंत प्राइमर पुस्तकालय निर्माण और 3'-अंत प्राइमरों प्रतिस्थापित किया गया के रूप में ही था प्राइमरों भी है कि एक अतिरिक्त SP6 अंत 3'में प्रतिलेखन प्रमोटर (चित्रा 1 और 2, चरण घ) निहित मिलान के साथ. प्रतिक्रिया / संकरण ligation के उत्पादों तो इन विट्रो आरएनए प्रतिलेखन (चित्र 1 और 2, चरण ई) में के लिए इस्तेमाल किया गया . आरएनए प्रतिलेखन के बाद, ligated DNAs (अचयनित आत्म पुल डीएनए टुकड़ा सहित) DNase द्वारा पचा थे मैं दखल पृष्ठभूमि दृश्यों को हटाने के लिए. रिवर्स प्रतिलेखन (आर टी) पीसीआर डेटा से पता चला है कि प्राइमर – पुनर्जीवित उत्पादों कुशलतापूर्वक, reamplified थे चयन की एक "दौर" (चित्रा 1 और 2, च चरण) का गठन. पृष्ठभूमि कोई आरटी नियंत्रण पीसीआर में उच्च चक्र संख्या में दिखाया प्रवर्धन पूरी तरह से एक अतिरिक्त DNase मैं पाचन द्वारा हटाया जा सकता है, और कम चक्र संख्या है, जो हम नियमित रोजगार के बाद detectable नहीं है. चयन के 7 राउंड के बाद, aptamers बंधन संपत्तियों के लिए विशेषता थे. केडी 10 10 -8 -7 एम रेंज (चित्रा 3) में सभी थे. बंधन assays में aptamers के विभिन्न जोड़े additive के बंधन से पता चला है, यह दर्शाता है कि वे S100B प्रोटीन पर विशिष्ट साइटों को लक्षित. इसलिए हम दोनों ग्लास (Codelink स्लाइड्स) प्रोटीन fluorescently टैग दूसरा aptamers का उपयोग कर, और दूसरा aptamers के साथ derivatized सोने nanowires के 50 एनएम सोने के नैनोकणों (चित्रा 3 AuNPs) करने के लिए युग्मित पर "सैंडविच" बाध्यकारी assays में aptamers के जोड़े का परीक्षण किया. दोनों ही मामलों में, बाध्यकारी विशिष्टता उच्च गया था: Codelink प्रोटीन पर, कोई सैंडविच बंधन aptamers जो additive केडी determinations में बाध्यकारी नहीं दिखा था के साथ मनाया गया. Derivatized nanowires के साथ हम वस्तुतः गैर – लक्ष्य प्रोटीन के लिए कोई बाध्यकारी है, और व्यक्तिगत सैंडविच परिसरों aptamer युग्मित AuNPs (चित्रा 3) के माध्यम से देखा जा सकता है है मनाया. 2. माल 2.1. पीएफ डीएनए पुस्तकालय और बन्धे टुकड़े के Reamplification पीढ़ी विवरण पान और Clawson, 2009 में वर्णित हैं, पान एट अल, 2008.. 2.2. शुद्ध प्रोटीन के आधार पर चयन 20 मिमी Tris – एचसीएल, 7.4 पीएच 32 + टुकड़ा और 30 + टुकड़ा चयन बफर (2.5 मिमी 2 CaCl 1X फास्फेट में 5 मिमी 2 MgCl खारा, buffered 7.4 पीएच, Gibco) नी NTA agarose मोती (Qiagen) Polypropylene स्तंभ (Qiagen) बंधन बफर (50 मिमी ना 2HPO 4-नाह 2 4 पीओ, pH7.2, 150 मिमी NaCl) व्यक्त शुद्ध बंधन बफर में S100B प्रोटीन (5 μg / μL) Phenol: ChCl3: IAA (7.9 पीएच, Ambion) एम 3 राष्ट्रीय मूल्यांकन एवं प्रत्यायन परिषद, 5.2 पीएच 100%, और 70% इथेनॉल 2.3. Topo क्लोनिंग और चयनित dsDNA पुस्तकालय के अनुक्रमण विश्लेषण 7 वें दौर पीसीआर उत्पादों का चयन (अतिरिक्त दौर जारी रखने के लिए aptamer बाइंडिंग के अनुकूलन किया जा सकता है है) pCR2.1 Topo वेक्टर (Invitrogen) DH5 घटक कक्ष (Invitrogen) प्लाज्मिड मिनी किट (Qiagen) M13 आगे प्राइमर Informax वेक्टर NTI (Invitrogen) 2.4. Aptamers के बंधन अभिलक्षण Aptamers और नियंत्रण oligos (एन 30 सीसी और 30 एन, IDT) टी -4 polynucleotide kinase (न्यू इंग्लैंड Biolabs) γ-32 पी एटीपी (3000 Ci / mmol, 10 μCi / एमएल) बंधन बफर में शुद्ध S100B (5 μg μL /) 2.5. शुद्ध S100B प्रोटीन और चयनित aptamers के साथ सैंडविच बंधन Assays 1 सेंट aptamer या तो ए के लिए युग्मित किया गया था) Codelink माइक्रोएरे स्लाइड्स या ज.) Au nanowires. शुद्ध S100B प्रोटीन, एक के लिए या तो 70 μl में 0.125 सुक्ष्ममापी को पतला) या 1 ख के लिए 50 μl में सुक्ष्ममापी). 2 एन डी aptamer या तो ए के साथ चिह्नित किया गया है) Codelink सरणी स्लाइड्स के लिए 546 Alexafluor, या ज.) derivatized Au nanowires के साथ अध्ययन के लिए 50 एनएम AuNPs के लिए युग्मित. 3. तरीके 3.1. पीएफ डीएनए पुस्तकालय का सृजन पान एट अल, 2008; aptamer चयन के लिए विस्तृत तरीके और प्रोटोकॉल पान और Clawson, 2009 में पाया जा सकता है . 3.2. Aptamer चयन शुद्ध S100B प्रोटीन का उपयोग मानव S100 कैल्शियम बंधनकारी प्रोटीन बी (S100B. जीन आईडी 6285 #) एक लक्ष्य के रूप में इस्तेमाल किया गया था. उनकी छह टैग S100B प्रोटीन (लंबाई में 98 अमीनो एसिड) को व्यक्त किया गया था और QIAexpressionist प्रणाली का उपयोग करके शुद्ध. (QIAGEN). यदि वांछित या संकेत, उनके 6 टैग enzymatically हटाया जा सकता है. चयन के दौर के दौरान, हर कदम से 1 μL नमूना तरल करने के लिए समग्र बाध्यकारी दक्षता निर्धारित गिनती जगमगाहट के लिए सहेजी गई थी. 3.2.1. पीएफ लाइब्रेरी डीएनए टुकड़े की तैयारी के 32 और 20 मिमी Tris – एचसीएल, पीएच 7.4 40 μL में + 30 + टुकड़े पुनः निलंबित . हीट 85 पर 3 मिनट डिग्री सेल्सियस, और 37 के लिए शांत ° C 37 के एक मशीन डिग्री सेल्सियस में 3 मिनट के लिए चयन बफर के 760 μL जोड़ें (2.5 मिमी 2 CaCl 1X फास्फेट में 5 मिमी 2 MgCl खारा, buffered पीएच 7.4, GIBCO) और 37 पर 3 मिनट के लिए सेते ° सी, तो 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आर टी) पर रखें. एक कॉलम नी NTA agarose मोती (QIAGEN) निहित पूर्व चयन बफर के साथ धोया, तब उपयोग करें जब तक आरटी पर रखने के माध्यम से गुजरती हैं. 3.2.2. नी NTA agarose मनका आरटी पर बाध्य S100B की तैयारी नीचे 3 सेकंड के लिए नी NTA agarose मोतियों की 400 μL स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. बाध्यकारी बफर के 400 μL (50 मिमी ना 2 HPO 4-नाह 2 4 पीओ pH7.2, 150 मिमी NaCl) धीरे 5 बार pipetting द्वारा, तो नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागने के साथ मोती धो लें . कदम 2 में दो बार दोहराएँ. शुद्ध S100B (5 / μg μL, बंधन बफर में निलंबित कर दिया) के 400 μL जोड़ें और धीरे से 5 बार 15 मिनट की कुल के लिए हर 3 मिनट विंदुक. नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. बाध्यकारी बफर के 400 μL के साथ धीरे से 3 बार pipetting द्वारा मनका – बाउंड S100B धो, तो नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. दोहराएँ 6 दो बार कदम. 3.2.3. S100B बाध्य Aptamers का चयन 3.2.1 से + टुकड़े मनका बाध्य S100B के लिए और 30 – 32 + स्थानांतरण. 15 मिनट के लिए सेते हैं और धीरे धीरे pipetting से हर 3 मिनट मिश्रण. बाध्यकारी बफर के 800 μL के साथ धीरे pipetting S100B – डीएनए जटिल धो, तो नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. कदम 3 में दो बार दोहराएँ. 3.2.4. S100B चयनित aptamers की रिकवरी जोड़ें 200 μL 20 मिमी (pH7.4) Tris – एचसीएल, गर्मी 85 3 मिनट ° सी, भंवर 1 मिनट और स्पिन से नीचे है, तो एक ताजा ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला. एक कदम एक बार दोहराएँ, और supernates गठबंधन. पिछले प्रकाशनों (11, 12) से प्रति 9-12 कदम के रूप में चयनित डीएनए टुकड़े का शुद्ध. कहा 3.2.5. Topo क्लोनिंग और अनुक्रमण सहमति aptamer दृश्यों की पहचान के लिए विश्लेषण PCR2.1 Topo वेक्टर (Invitrogen से) में पीसीआर उत्पादों का चयन 10 वें दौर क्लोन . अतिरिक्तक्लोनिंग के रूप में आगे चयन प्रदर्शन कर रहे हैं किया जा सकता है. अनुक्रम M13 आगे प्राइमर (हम Hershey मेडिकल सेंटर में आण्विक आनुवंशिकी कोर सुविधा का उपयोग करें) के साथ 40-50 एकल कालोनियों. चयनित Informax वेक्टर NTI (Invitrogen) का उपयोग कर दृश्यों संरेखित करें. संरेखण पर आधारित सर्वसम्मति दृश्यों का निर्धारण करते हैं. सहमति aptamers तो एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज से खरीदे गए थे. 3.3. चयनित Aptamers के जोड़े के साथ सैंडविच बंधन Assays 3.3.1. माइक्रोएरे प्रारूप का उपयोग fluorescently 2 एन डी aptamers लेबल. सहमति 1 सेंट Aptamers 5'-amineC6 आधा भाग के साथ संश्लेषित किया गया. वे मुद्रण बफर में 15 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए निलंबित कर दिया गया और Codelink सक्रिय स्लाइड (जीई हेल्थकेयर / Amersham बायोसाइंसेज) डीएनए माइक्रोएरे सुविधा पीएसयू, विश्वविद्यालय पार्क में एक Apogent खोजों microgrid Arrayer का उपयोग पर देखा) Codelink सिफारिश प्रोटोकॉल का पालन. 12 arrays के साथ प्रत्येक स्लाइड मुद्रित किया गया था. संकरण एक 2 x 8 स्वरूप माइक्रोएरे संकरण कैसेट्स (यह सरणी, TeleChem इंटरनेशनल) में किया गया. माइक्रोएरे कैसेट्स nuclease मुक्त चिपकने वाला सील पन्नी (AlumaSeal द्वितीय, अनुसंधान उत्पाद अंतर्राष्ट्रीय) का उपयोग करने के लिए वाष्पीकरण रोकने के सील किया गया. S100B प्रोटीन पीबीएस में 70 μl में उचित एकाग्रता के लिए पतला किया गया था और माइक्रोएरे कैसेट के कुओं के लिए लागू होता है. बंधन Codelink स्लाइड पर मुद्रित aptamers के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए किया गया था. कैसेट के कुओं तो व्यक्तिगत पीबीएस + 5 मिमी 2 MgCl (PBSM) के साथ 3X धोए, और अतिरिक्त धोने बफर blotted किया गया था . fluorescently लेबल aptamers 70 μl में 0.125 सुक्ष्ममापी PBSM में पतला थे, और फिर 85 से गरम डिग्री सेल्सियस 3 बर्फ पर 3 मिनट के बाद मिनट के लिए. Aptamers माइक्रोएरे कैसेट के कुओं के लिए लागू किया गया, और कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए incubated. वेल्स फिर व्यक्तिगत PBSM साथ 3X थे धोया. कैसेट तो अलग लिया गया था, विज्ञापन पूरे स्लाइड PBSM में rinsed था. स्लाइड तो पूरी तरह centrifugation द्वारा सूखे, और एक स्कैनिंग पैकार्ड बायोसाइंसेज ScanArray 4000XL (Perkin एल्मर) का उपयोग कर स्कैन. 3.3.2. Derivatized Nanowire 2 एन डी 50 एनएम AuNPs के लिए मिलकर aptamers प्रारूप का उपयोग गोल्ड NWS (~ लंबाई में 5 सुक्ष्ममापी, व्यास में 320 एनएम) पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल (13, 14) का पालन झरझरा एल्यूमिना झिल्ली के भीतर galvanostatic electrodeposition के द्वारा संश्लेषित किया गया. झरझरा झिल्ली के विघटन पर, nanowires 1 एमएल इथेनॉल में resuspended थे. के रूप में उल्लेख किया, डीएनए एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज से खरीदा गया था. सोना नैनोकणों (50 एनएम) टेड पेला से खरीदे गए थे. Thiolated डीएनए 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट 8.3 पीएच में एक घंटे के लिए 100 मिमी डीटीटी के साथ cleaved किया गया था और फिर एक Centri स्पिन 10 स्तंभ में शुद्ध. गोल्ड NWS और एनपीएस के लिए अनुलग्नक aptamer एक Au nanowires के 50 μL विभाज्य एक 0.5 एमएल गैर छड़ी अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखा गया था और 10 मिमी फॉस्फेट बफर, 300 मिमी NaCl, 7.4 पीएच में rinsed. 5 'अंत (10 पर 5 टी स्पेसर के साथ' अंत) पर thiolated डीएनए 0.4 सुक्ष्ममापी की एक अंतिम एकाग्रता में तारों को जोड़ा गया है. नमूना 30 मिनट के लिए vortexed किया गया था और तब centrifugation (8100 ग्राम) द्वारा 10 मिमी फॉस्फेट बफर, 300 मिमी NaCl, पीएच 7.4 50 मिमी फॉस्फेट बफर, 5 मिमी 2 MgCl, पीएच 7.2 के साथ और तीन बार के साथ तीन बार rinsed. डीएनए लेपित तार 100 μL आधे से पतला बफर में resuspended थे. डीएनए derivatized AuNPs 1 एमएल 50 एनएम AuNPs 50 μl 100 मिमी 2 एन डी aptamer (अंत 5'पर 10 टी के साथ एक स्पेसर) को जोड़ने और 37 पर गर्म ° C एक घंटे के लिए तैयार थे. हीटिंग के बाद, 10 मिमी सोडियम फॉस्फेट बफर, 1M NaCl, 7.4 पीएच (100 μL, μL 150, और 128 μL द्वारा 25 μL दो बार, का पालन) 0.5 घंटे के अंतराल में जोड़ा गया था. conjugates एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक उपयोग से पहले रात भर पर छोड़ दिया गया. नमूने 50 मिमी फॉस्फेट बफर, 5 मिमी 2 MgCl, पीएच 7.2 से 3 बार rinsed थे. Conjugates 120 μL बफर में resuspended थे. NWS पर सैंडविच संकरण डीएनए लेपित तार, 1 पतला μL, पीसीआर नलियों में बफर करने के लिए जोड़ा गया था. S100B प्रोटीन या HtrA1 नियंत्रण प्रोटीन (1 μg / μL) 50 μL बफर (~ 10-12 प्रोटीन अणुओं Au nanowire सतह के वर्ग नैनोमीटर प्रति जोडी गयी) में 1 सुक्ष्ममापी की अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा गया है. नमूने ~ 2 बजे के लिए vortexed थे. तारों rinsed थे centrifugation (8100 ग्राम) द्वारा 50 मिमी फॉस्फेट बफर, 5 मिमी 2 MgCl, पीएच 7.2 के साथ तीन बार थे और प्रत्येक 20 μL / AuNP डीएनए conjugates में resuspended . तारों 2 घंटा के लिए conjugates में vortexed थे, और तब (1300 ग्राम) centrifugation द्वारा 5x rinsed थे 50 मिमी फॉस्फेट बफर, 5 मिमी 2 MgCl, 7.2 पीएच के साथ अतिरिक्त नैनोकणों को हटाने. नमूने में resuspended थे20 μL बफर और Au FE-SEM विश्लेषण के लिए लेपित सी वेफर्स पर सूखे. Nanowires के FE-SEM छवियों लियो 1530 फील्ड इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप स्कैनिंग 5.00 केवी ऑपरेटिंग वोल्टेज में एक Schottky इलेक्ट्रॉन क्षेत्र उत्सर्जन स्रोत का उपयोग उत्सर्जन का उपयोग करके प्राप्त किया गया. 4. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1. प्रोटोकॉल प्राइमर – 5'मुक्त (1 पीएफ) और प्राइमर मुक्त (2 पीएफ). (ए) पीएफ 1 डीएनए aptamer चयन प्रोटोकॉल. पुस्तकालय oligonucleotides annealed एक साथ कर रहे हैं, और पीसीआर प्रवर्धन के अधीन एक डबल असहाय डीएनए पुस्तकालय उपज (क). 5'-अंत प्राइमर मुफ्त (1 पीएफ) पीएफ एकल असहाय डीएनए पुस्तकालयों से यादृच्छिक क्षेत्र Nt.BstNBI / Nt.BbvCI (दरार साइटों लाल arrowheads के साथ चिह्नित कर रहे हैं) digestions और जेल purifications द्वारा तैयार किया जाता है, और आत्म पुल (काला तीर) जेल शुद्धि (ख) द्वारा अलग है. (ग) के चयन के बाद चयनित दृश्यों (नामित pS30 सीसी) उनके इसी oligomers और आत्म पुल के साथ संकरित हैं और फिर से पहले हटा प्राइमर क्षेत्रों उत्पन्न ligated. इस स्तर पर, प्राइमरों पेश कर रहे हैं कि 3'अंत में एक SP6 प्रमोटर (घ) होते हैं. यह तो शाही सेना के लिए चयनित क्षेत्रों (ई) से युक्त नक़ल करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अंत में, शाही सेना है तो विशेष रूप से (टेम्पलेट डीएनए पचता है) प्रवर्धित RT-पीसीआर (च), और चयनित उप पुस्तकालय का उपयोग कर चयन के अगले दौर के लिए तैयार है. (बी) 2 पीएफ चयन डीएनए aptamer प्रोटोकॉल. पुस्तकालय oligonucleotides के साथ annealed रहे हैं और पीसीआर प्रवर्धन के अधीन एक डबल असहाय डीएनए पुस्तकालय उपज (क). प्राइमर मुक्त (2 पीएफ) पीएफ एकल असहाय डीएनए लाइब्रेरी से यादृच्छिक क्षेत्र Nt.BstNBI / BspMI (कटौती साइटों arrowheads के साथ चिह्नित हैं) digestions और जेल शुद्धि द्वारा तैयार की है . आत्म पुल या तो पीएफ 1 प्रोटोकॉल और / या एकल Nt.BstNBI (ख) के साथ शुरू पुस्तकालय के पाचन से अलग है, जेल शुद्धि के साथ मिलकर. (ग) के चयन के बाद चयनित दृश्यों (pS30 नामित) उनके इसी oligomers और आत्म पुल के साथ संकरित हैं, और पहले से हटा प्राइमर क्षेत्रों को पुनर्जीवित करने के लिए ligated. पीएफ में 1 के रूप में, प्राइमरों पेश कर रहे हैं कि 3'अंत में एक SP6 प्रमोटर (घ) होते हैं. यह तो शाही सेना के लिए चयनित क्षेत्रों (ई) से युक्त नक़ल करने के लिए प्रयोग किया जाता है. शाही सेना के विशेष रूप से है तो RT-पीसीआर (च) का उपयोग reamplified, और चयनित उप पुस्तकालय – चयन के अगले दौर के लिए तैयार है. चित्रा 2. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और प्रयोगात्मक परिणाम / कमी पीएफ चयन प्रोटोकॉल का अभ्यास. निर्दिष्ट चरणों चित्र 1 में दर्शाया उन के अनुरूप हैं. पीएफ पीसीआर प्रतिबंध endonucleases के साथ (के रूप में संकेत) (क चरण) द्वारा निर्मित पुस्तकालय के पाचन के बाद, पचा उत्पादों PAGE द्वारा एक 10% जेल पर denaturing शर्तों के तहत अलग हो गए थे. इसी पीएफ 1 और पीएफ 2 चयन प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त टुकड़े (ख चरण) दिखाए जाते हैं . (ग चरण) के चयन के बाद, बाध्य aptamers उनके इसी oligomers और आत्म पुल के साथ संकरित हैं, और पहले से हटा प्राइमर क्षेत्रों को पुनर्जीवित करने के लिए ligated. 3'के अंत में, प्राइमरों पेश कर रहे हैं कि 3'अंत में एक SP6 प्रमोटर (चरण घ) शामिल 32 पी लेबल RNAs थे 1 के ligated उत्पादों, 0.5, 0.25, 5 μl प्रतिक्रियाओं से 0.125 μl का उपयोग लिखित, और थे denaturing शर्तों (चरण ई) के तहत 6% जैल पर PAGE द्वारा अलग. टेप तो DNase के साथ इलाज किया गया अचयनित यादृच्छिक डीएनए क्षेत्रों को हटा, सीडीएनए में लिखित उलटने के लिए, और फिर 7, 14, 21, या 28 पीसीआर चक्र के लिए reamplified. उत्पाद गैर denaturing शर्तों के तहत 8% जैल पर पृष्ठ से अलग थे. 66 NT के टुकड़ा पूर्ण लंबाई चयनित pS30 सीसी और pS30 दृश्यों के रूप में फिर से 5 'और 3' flanking दृश्यों के भीतर एम्बेडेड युक्त उत्पाद का प्रतिनिधित्व करता है. PhiX174/HinfI मार्करों के प्रवासन के बाएँ में दिखाया गया है (च चरण). नियंत्रण रिवर्स प्रतिलेखन कदम (आर टी) की चूक भी शामिल हैं. ऐसे नमूनों में एक उत्पाद की एक छोटी राशि के उच्च चक्र संख्या में देखा जा सकता है, इस संभाव्यतः पूरी तरह से एक दूसरे (या लंबे समय तक) DNase पाचन कदम के साथ समाप्त किया जा सकता है. चित्रा 3. चयनित aptamers और उनके एक सैंडविच स्वरूप में बनती प्रयोग करें बंधन अभिलक्षण. एकाग्रता ए – आश्रित केडी निर्धारण के लिए 32 पी aptamer बाध्यकारी . Aptamers थे 5'-अंत जी पी – एटीपी-32 (3000Ci/mmol ~ 10 एमसीआई) और टी -4 polynucleotide kinase (न्यू इंग्लैंड Biolabs) का उपयोग लेबल और बाध्यकारी वाएस निर्धारित के रूप में वर्णित है. बी 5'-amine-derivatized 1 सेंट aptamers प्रोटीन Codelink मिलकर थे. शुद्ध S100B प्रोटीन 1 सेंट aptamer करने के लिए बाध्य किया गया था, स्लाइड्स को अच्छी तरह से rinsed थे, और AlexaFluor546 लेबल 2 एन डी aptamer 1 सेंट aptamer करने के लिए बाध्य किया गया था: S100B परिसरों. Rinsing के माध्यम से के बाद, प्रतिदीप्ति एक ScanArray स्कैनर का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया गया था. सी. 5'-thiol derivatized 1 सेंट aptamers Au मानक thiol रसायन शास्त्र nanowires उपयोग करने के लिए युग्मित किया गया . 2 एन डी aptamers एक ही तरीके से 50 एनएम AuNPs युग्मित थे. शुद्ध S100B प्रोटीन (बाएं) या शुद्ध HtrA1 नियंत्रण प्रोटीन (दाएं) तो derivatized nanowires करने के लिए पहली ही था. के बाद पूरी तरह से rinsing, 2 एन डी aptamer 50 एनएम AuNPs बाद 1 सेंट aptamer-nanowire के लिए बाध्य किया गया: S100B परिसरों . Rinsing के माध्यम से के बाद, बाध्य सैंडविच परिसरों क्षेत्र उत्सर्जन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग का उपयोग करते हुए कल्पना थे. स्केल सलाखों = 1 सुक्ष्ममापी.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनकी मदद के लिए माइक्रोएरे कोर सुविधा पर क्रेग पॉल धन्यवाद. यह काम NIH / NCI अनुदान # CA118591 IMAT कार्यक्रम से समर्थित किया गया था. SLD भी वित्तीय सहायता के लिए एक पेंसिल्वेनिया अंतरिक्ष अनुदान कंसोर्टियम फैलोशिप मानता है. इस प्रकाशन भी पेंसिल्वेनिया राज्य विश्वविद्यालय सामग्री अनुसंधान संस्थान नैनो निर्माण नेटवर्क और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन सहकारी समझौते नंबर 0335765, राष्ट्रीय नैनो इंफ्रास्ट्रक्चर नेटवर्क कॉर्नेल विश्वविद्यालय के साथ, द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tris-HCl | ||||
| HotMaster TAQ DNA Polymerase | 5-Prime | |||
| dNTP Mix | Sigma | |||
| Acrylamide | Fisher | |||
| UltraPure 10X TBE Buffer | Invitrogen | |||
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | |||
| TEMED | Fisher | |||
| PhiX174 DNA/Hinf I DNA Marker | Promega | |||
| Ethidium Bromide | ||||
| α-32P-dCTP | ||||
| Phenol:ChCl3:IAA | Ambion | |||
| NaCl | ||||
| Ethanol | ||||
| Restriction Enzymes | NEB | |||
| Urea | Fisher | |||
| Photographic Film | ECE Scientific | |||
| PBS | Gibco | |||
| CaCl2 | Gibco | |||
| MgCl2 | Gibco | |||
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | |||
| Polypropylene Column | Qiagen | |||
| NaHPO4 | ||||
| NaAc | ||||
| Detroit-551 cells | ||||
| SK-MEL-31 cells | ||||
| MEM | ||||
| TrypLE Express | Gibco | |||
| T4 DNA Ligase | NEB | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Promega | |||
| Sp6 RNA Polymerase | Promega | |||
| RNase-Free DNase I | Promega | |||
| RNase Inhibitor | Promega | |||
| SensiScript Reverse Transcriptase | Qiagen | |||
| pCR-2.1-TOPO Vector | Invitrogen | |||
| DH5α Compotent Cells | Invitrogen | |||
| Plasmid Mini Kit | Qiagen | |||
| Vector NTI | Invitrogen | |||
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | |||
| γ-32P-ATP |
Referências
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Pan, W., Xin, P., Patrick, S., Dean, S., Keating, C., Clawson, G. Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library. J. Vis. Exp. (41), e2039, doi:10.3791/2039 (2010).