Embryo Microinjection: Eine Technik, um eine Verbindung in das Zebrafisch-Eigelb zu liefern
Published: April 30, 2023
Abstract
Quelle: Sorlien, E. L., et al. Effiziente Produktion und Identifikation von CRISPR/Cas9-generierten Gene Knockouts im Modellsystem Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).
Dieses Video beschreibt eine Technik der Embryo-Mikroinjektion, um Verbindungen in Zebrafisch-Dottersack zu liefern.
Protocol
1. Mikroinjektion von CRISPR-Komponenten in Zebrafisch-Embryonen Richten Sie Zuchttanks in der Nacht vor der Injektion ein, indem Sie die Anzahl der gewünschten Männchen und Weibchen (in der Regel 2 Weibchen und 1 oder 2 Männchen) in einem Zuchttank mit einem Teiler platzieren. Bereiten Sie eine Mikroinjektionsplatte mit 1,5% Agarose in 1x E3-Medien (siehe Materialtabelle) mit 0,01% Methylenblau (ein Fungizid) vor, indem Sie 35 ml der geschmolzenen Agarose in eine 10 cm Petrischale…
Representative Results
Abbildung 1: Vergleich der Gesundheit von 24 hpf injizierten Embryonen. Ein lebender Embryo (A), der auf 24 hpf entwickelt wurde, unterscheidet sich leicht von einem Embryo, der die Entwicklung abgebrochen hat (B). Embryonen, die (B) ähneln oder drastisch veränderte Merkmale von (A) haben, wie z. B. Wirbelsäulenkrümmung oder veränderte Kopf- und Augenentwicklung, sollten aus der Schale entfernt werden
Materials
| RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. |
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| E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449 |
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| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
| Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
| Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos | |
| Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
| Incubator | Maintaining embryos at 28.5 C. | ||
| Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long |
| Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles |
| Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
| Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
| Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection | |
| PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. |
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Embryo Microinjection: A Technique to Deliver a Compound into the Zebrafish Yolk. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20196, doi: (2023).