Microinyección de Gonad: Un método de entrega compuesta directamente en la línea germinosa de C. elegans
Published: April 30, 2023
Abstract
Fuente: Farboud, B. et al, Edición mejorada del genoma con Cas9 Ribonucleoprotein en diversas células y organismos. J. Vis. (2018).
Este video describe la microinjección, un método común de creación de cepas transgénicas de C. elegans. En el ejemplo, veremos microinyección utilizada para introducir un complejo de ribonucleoproteína (RNP) para la edición de genes de bases CRISPR.
Protocol
El siguiente protocolo es un extracto de Farboud et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp. (2018). 1. Asamblea RNP Diseñe el experimento con mucha antelación, adquiriendo todos los componentes de ARN, ADN y proteínas con anticipación. Como primer paso, pruebe uno d…
Representative Results
Tabla 1: Controles positivos para experimentos preliminares de edición del genoma. Esta tabla muestra la información clave necesaria para realizar un experimento de edición del genoma por primera vez en cada una de las células y organismos descritos en este protocolo. Seguir estos parámetros es probable que produzca un resultado exitoso que se pueda utilizar para probar el protocolo o como línea base…
Materials
| Reagents/Materials | |||
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | – | IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1 |
| Guide RNAs | Synthego | – | Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1 |
| Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) | New England Biosciences | M0646T | If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option |
| OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP-50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Nematode Growth Media agar in petri dishes | – | – | See Stiernagle, T (ref. 59) |
| Standard borosilicate glass capillaries with filament: 4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
| Cover glass; 24 × 50 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-544E | |
| Cover glass; 22 × 22 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-518-105K | |
| Apex LE agarose | Genesee Scientific | 20-102 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| pCFJ90 plasmid | Addgene | 19327 | |
| Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm) | World Precision Instruments | T2100F-4 | |
| Petri dishes (100 × 15 mm) | – | ||
| 9" pasteur pipettes | – | ||
| Nuclease-free water | – | ||
| Equipment | |||
| MZ75 Stereomicroscope | Leica | Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope | |
| Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope | Zeiss | Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1 | |
| Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol) | Sutter Instrument | FG-P2000 | |
| Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol) | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-202U | |
| Coarse manipulator | Narishige International | MMN-1 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| NG-agar |
Citar este artigo
Gonad Microinjection: A Method of Compound Delivery Directly into the Germline of C. elegans. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20168, doi: (2023).