Gonad Microinjection: שיטה של משלוח מורכב ישירות לתוך הנבט של C. אלגנס
Published: April 30, 2023
Abstract
מקור: Farboud, B. ואח ‘, עריכת גנום משופרת עם Cas9 ריבונוקלאופרוטאין בתאים מגוונים ואורגניזמים. ג’יי ויס אקספ. (2018).
וידאו זה מתאר microinjection, שיטה נפוצה של יצירת זנים מהונדסים C. elegans. בדוגמה, נראה microinjection המשמש להצגת קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין (RNP) לעריכת גנים של בסיסי CRISPR.
Protocol
הפרוטוקול הבא הוא קטע מתוך Farboud et al, עריכת גנום משופרת עם Cas9 ריבונוקלאופרוטאין בתאים ואורגניזמים מגוונים, J. Vis. Exp. (2018). 1. הרכבת RNP תכנן את הניסוי מבעוד מועד, ורכש מראש את כל רכיבי ה- RNA, ה- …
Representative Results
טבלה 1: בקרות חיוביות לניסויים ראשוניים בעריכת גנום. טבלה זו מציגה את המידע העיקרי הדרוש לביצוע ניסוי עריכת גנום בפעם הראשונה בכל אחד מהתאים והאורגניזמים המתוארים בפרוטוקול זה. ביצוע פרמטרים אלה עשוי להניב תוצאה מוצלחת שניתן…
Materials
| Reagents/Materials | |||
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | – | IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1 |
| Guide RNAs | Synthego | – | Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1 |
| Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) | New England Biosciences | M0646T | If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option |
| OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP-50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Nematode Growth Media agar in petri dishes | – | – | See Stiernagle, T (ref. 59) |
| Standard borosilicate glass capillaries with filament: 4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
| Cover glass; 24 × 50 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-544E | |
| Cover glass; 22 × 22 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-518-105K | |
| Apex LE agarose | Genesee Scientific | 20-102 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| pCFJ90 plasmid | Addgene | 19327 | |
| Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm) | World Precision Instruments | T2100F-4 | |
| Petri dishes (100 × 15 mm) | – | ||
| 9" pasteur pipettes | – | ||
| Nuclease-free water | – | ||
| Equipment | |||
| MZ75 Stereomicroscope | Leica | Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope | |
| Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope | Zeiss | Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1 | |
| Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol) | Sutter Instrument | FG-P2000 | |
| Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol) | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-202U | |
| Coarse manipulator | Narishige International | MMN-1 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| NG-agar |
Citar este artigo
Gonad Microinjection: A Method of Compound Delivery Directly into the Germline of C. elegans. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20168, doi: (2023).