Gonad Microinjection: Eine Methode der zusammengesetzten Lieferung direkt in die Keimbahn von C. elegans
Published: April 30, 2023
Abstract
Quelle: Farboud, B. et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms. J. Vis. (2018).
Dieses Video beschreibt die Mikroinjektion, eine gängige Methode zur Schaffung transgener C. elegans-Stämme. Im Beispiel sehen wir, wie Mikroinjektionverwendet wird, um einen Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex für die GENbearbeitung von CRISPR-Basen einzuführen.
Protocol
Das folgende Protokoll ist ein Auszug aus Farboud et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp. (2018). 1. RNP-Baugruppe Entwerfen Sie das Experiment rechtzeitig und erwerben Sie alle RNA-, DNA- und Proteinkomponenten im Voraus. Versuchen Sie zunächst eine der in Tabelle …
Representative Results
Tabelle 1: Positive Kontrollen für vorläufige Genombearbeitungsexperimente. Diese Tabelle zeigt die wichtigsten Informationen, die für die Durchführung eines ersten Genombearbeitungsexperiments in jeder der in diesem Protokoll beschriebenen Zellen und Organismen erforderlich sind. Das Folgen dieser Parameter wird wahrscheinlich zu einem erfolgreichen Ergebnis führen, das verwendet werden kann, um das …
Materials
| Reagents/Materials | |||
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | – | IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1 |
| Guide RNAs | Synthego | – | Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1 |
| Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) | New England Biosciences | M0646T | If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option |
| OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP-50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Nematode Growth Media agar in petri dishes | – | – | See Stiernagle, T (ref. 59) |
| Standard borosilicate glass capillaries with filament: 4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
| Cover glass; 24 × 50 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-544E | |
| Cover glass; 22 × 22 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-518-105K | |
| Apex LE agarose | Genesee Scientific | 20-102 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| pCFJ90 plasmid | Addgene | 19327 | |
| Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm) | World Precision Instruments | T2100F-4 | |
| Petri dishes (100 × 15 mm) | – | ||
| 9" pasteur pipettes | – | ||
| Nuclease-free water | – | ||
| Equipment | |||
| MZ75 Stereomicroscope | Leica | Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope | |
| Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope | Zeiss | Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1 | |
| Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol) | Sutter Instrument | FG-P2000 | |
| Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol) | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-202U | |
| Coarse manipulator | Narishige International | MMN-1 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| NG-agar |
Citar este artigo
Gonad Microinjection: A Method of Compound Delivery Directly into the Germline of C. elegans. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20168, doi: (2023).