액체 배양에 RNAi 공급: C. elegans에서 유전자 발현을 녹여 고처리량 방법
Published: April 30, 2023
Abstract
출처: 그로, N. 외. Caenorhabditis elegans에서나이와 내재된 단백질 집계의 변화를 연구하는 방법. J. 비스 익스펙. (2017).
RNAi는 C. elegans 연구원에 사용할 수 있는 강력한 유전 도구. 이 비디오는 액체 배양 조건을 활용하여 플레이트 공급보다 RNAi로 더 많은 벌레를 치료하는 방법을 소개합니다.
Protocol
이 프로토콜은 그로 외에서발췌, Caenorhabditis elegans에서나이와 고유 단백질 집계의 변화를 연구하는 방법, J. Vis. Exp. (2017). 1. 관심 유전자를 대상으로 RNAi를 대상으로 하는 젊고 숙성된 동물을 수집하는 고나드없는 동물의 액체 문화 <strong cla…
Materials
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents | yes |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1E+06 | GL45 | yes |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | yes | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml | no |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 3E+05 | no | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 3E+05 | no | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | no | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 | no |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 5E+09 | Complete Mini EDTA-free tablets | no |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 | no |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | no | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) | no |
| DNaseI | Roche | 5E+09 | recombinant, RNase free | no |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution | no |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain | no |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain | no |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | no | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | no | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | no | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | no | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4E+06 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit | no |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 4E+05 | yes | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 4E+05 | no | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5E+09 | yes | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 6E+09 | yes | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 8E+07 | no | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5E+09 | Centrifugal evaporator | no |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | no | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | yes | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | no | |
| Software | no | |||
| Image analysis software | ImageJ | no | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | no | |
| E.coli strains | ||||
| OP50 | CGC | |||
| RNAi bacteria | ||||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | |||
| C. elegans mutants | ||||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | ||
| C. elegans transgenics | ||||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | ||
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | ||
Citar este artigo
RNAi Feeding in Liquid Culture: A High-Throughput Method to Knockdown Gene Expression in C. elegans. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20139, doi: (2023).