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Summary
恐怖の文脈における飛行行動を研究するために、修正された恐怖条件付けプロトコルを導入します。このプロトコルは、マウスが恐怖条件付けにおける手がかりの提示中に一貫して飛行行動を示すことを保証します。
Abstract
脅威的な状況での防御行動の適切な発現は、生存にとって重要です。有力な理論では、ジャンプや急降下などの能動的な防御行動は、脅威の差し迫った状態や実際の脅威が高い場合に表現され、凍結などの受動的な防御行動は、脅威が予測されるが、脅威の差し迫った状況が比較的低い場合に表現されるというものです。古典的な恐怖条件付けでは、被験者は通常、条件付けされた防御反応として凍結を示し、ほとんどの場合、積極的な防御行動の表現はほとんどありません。本稿では、条件刺激(CS;連続音、8kHz、95dB SPL(音圧レベル))と無条件刺激(US;フットショック、0.9mA、1.0秒)を2日間にわたって5回繰り返して、凍結から飛翔へ、またはその逆の移行を観察する修正恐怖条件付け手順を紹介する。この修正された恐怖条件付け手順は、比較的多くのコンディショニングセッションとコンディショニング日を必要としますが、飛行行動を控えめに表現するために高強度のフットショックを必要としません。コンディショニングと顕著なCSのプレゼンテーションに同じ文脈を使用することは、飛行行動を引き出すために不可欠です。この修正された恐怖条件付け法は、マウスの能動的な防御行動を観察するための信頼できる方法であり、恐怖の文脈におけるそのような行動の微細なメカニズムと特徴を解明する機会を提供します。
Introduction
脅威的な状況下での防御行動の適切な選択は、すべての動物の生存にとって非常に重要です。防御行動は、凍結行動と逃走行動の間の遷移など、脅威の近接性に基づいて徐々にシフトします1,2,3。これらの行動の調節不全は、さまざまな精神障害でしばしば観察されます4。心的外傷後ストレス障害(PTSD)は、脅迫的でない刺激に対するパニック反応など、誇張された防衛行動を特徴とする障害の1つです4。
げっ歯類の古典的恐怖条件付けは、PTSDのモデルとして一般的に用いられる5,6,7が、げっ歯類は、このモデル8では飛翔(パニック)行動を表現しない。その結果、しばしば「げっ歯類PTSDモデル」と呼ばれる古典的な恐怖条件付けモデルは、ヒトのPTSDの顔の妥当性を欠いており、特に十分に研究されていない逃避やパニックのような症状を捉えるという点では、その傾向が顕著である。
最近、いくつかの修正された恐怖条件付けプロトコルは、げっ歯類の被験者がこれらの手順中に飛行行動を示すことを成功裏に実証しました。例えば、条件刺激(CS)と無条件刺激(US)を1日に7回繰り返し関連付けることで、雌ラットは飛翔行動に似た急降下行動を示すことができた9。連続複合刺激(SCS;トーンとそれに続くノイズで構成される)を用いた2日間の恐怖条件付けでは、マウスはSCSプレゼンテーションのノイズ部分で飛行行動を示し始めました10,11,12。SCS法の詳細な説明は、プロトコルレポート13に記載されています。SCSによる3日間の恐怖条件付けは、ラットの飛翔行動を誘発する効果もあった14。ただし、これらの新しいプロトコルにはいくつかの制限があります。例えば、逐次キュー提示の使用は、近接推定が防御行動に及ぼす影響を排除することを許さない。ラットにおけるCS-USの7倍の会合の場合、飛行反応の大部分は雄ではなく雌で観察された。
これらの考慮事項に照らして、我々は、マウスが恐怖の文脈で飛翔行動を調査するために、修正された恐怖条件付けプロトコルを導入します。雄マウスは、修正された恐怖条件付けの間、一貫して飛行行動を示します。このプロトコルでは、SCS の代わりに顕著なトーンが CS として使用されます。さらに、1日に最低5組のCS-USを少なくとも2日間、条件付けされた状況による恐怖の増強とともに行う必要があります。このプロトコルは、研究目的に応じて、以前のプロトコルを補完し、飛行行動を調査するための別のオプションを提供します。
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Protocol
このプロトコールは、日本生理学会の指導原則に則って実施され、金沢医科大学動物管理委員会(2021-32)の承認を受けました。すべての手続きは、ARRIVEガイドラインに準拠して実施されました。C57BL/6Jの成体雄マウス(生後3-6ヶ月)を用いたが、これらのマウスが本稿15に記載の飛翔行動を示すことが既に確認されている。
1.動物の調製
- グループハウスマウス(ケージあたり3〜4匹、23〜27°Cで維持、12時間の明暗サイクルで、餌と水を自由自得で提供)実験開始まで。
- 各マウスをプレキシガラスのケージ(14 cm×21 cm×12 cm)に少なくとも3日間収容してから、この修正された恐怖条件付けを受けます。
2.工具/機器のセットアップ
- 恐怖条件付けボックス(図1A)
- 減音ボックス(67 cm××53 cm××55 cm)に封入された恐怖条件付けチャンバー(25 cm25 cm25 cm)を利用します( 材料表を参照)。
- 2 つのコンテキスト (A と B) が必要です。コンテキストAでは、白いプラスチックの段ボールを黒いテープで貼り付けて、壁に黒と白のストライプを作成します(幅3cm、ボードに4つ)。床には白い滑らかなプラスチック板を使用してください。
- 各セッションの前に、壁と床をヘプタノール(1%)で拭きます。.
注意: アクティブ換気システムは使用されていません。セッションの最後にアルコールで洗浄すると、ヘプタノールの臭いが軽減されます。 - コンテキスト B では、コンテキスト A で使用されているボードを削除して、壁の外観を全体的に黒くします。床は格子状の床です。
注意: クリーニング用のわずかなアルコール臭以外に特定の臭いはありません。 - 頭上の白色発光ダイオード(LED、240ルクス)を使用して実験箱を照らします( 材料表を参照)。
- ショッカー
- スクランブルショッカー( 材料表を参照)をステンレス鋼の棒で構成されたグリッド床に接続します。これは、足に衝撃を与えるために使用されます。足の衝撃強度は、恐怖条件付けの一般的な方法に従って0.9mAに設定されました10、11、12、13。
- オーディオジェネレータ
- 天井にスピーカー( 資料表を参照)を置きます。すべての音響刺激が増幅されます。
- 1/4インチマイクを使用して、スピーカーの前面5cmの音圧レベル(SPL、re:20 μ Pa)が得られるように、各刺激の全体的な振幅をデジタルで変更および校正します。このスピーカーから連続したトーンが流れます。
注:サウンドスピーカーのキャリブレーションは、この修正された恐怖条件付け中の防御行動に対する音刺激の微細な影響を調べるために重要です。
- トランスデューサー
- 振動を検出するために、試験室の床を探触子( 材料表を参照)の上に置きます。トランスデューサからの信号は、8 kHzのサンプリング周波数でサウンドカードに送信され、動作振動が記録されます。
- ビデオカメラ
- CMOSカメラ( 材料表を参照)を天井に配置して、被写体の動きを追跡し、コンディショニングボックスに音を記録します。
- トリガーシステム
- サウンドソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、スケジュールされたタイミングでトーンやフットショックをトリガーします。
注:市販の刺激装置ならどれでもこれに対応できます。
- サウンドソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、スケジュールされたタイミングでトーンやフットショックをトリガーします。
3. 行動実験
- 4日間の恐怖条件付け手順を計画します:慣れ(1日、5回の試行)、条件付け(2日間、それぞれ5回の試行)、およびテスト/消滅セッション(1日、5または15回の試行)。試験間の間隔は60〜75秒の間で変化しました(図1B)。
注:できれば、信頼できる行動傾向を得るために、グループに10人以上の被験者を含めます。研究の目的に応じて、2つまたは3つのグループが必要です。- コンディショニング・セッション中は、 図1Bに示すように、コンディショニング・スティミュラス(CS)の終了直後に無条件刺激(US)(1秒、0.9mA)を印加します(連続トーン・バースト、8kHz、20秒、95dB SPL)。コンディショニングの日に5組のCS-USを納品する。
- 5回目のフットショックが終わったら、対象を1分間その場に置いてからホームケージに戻します。各行動テストの後に、チャンバーを70%アルコールで拭いて洗浄します。
注:CSとUSの強度は、研究の目的に応じて変更できます。これまでの報告では、CS強度が強いと、CS強度が柔らかい場合よりも積極的な防御行動が引き起こされることが示されています15。コンディショニングの日数も延長できます。
- CSプレゼンテーション中に、以下のスケジュールに従って飛行行動を誘発します。
注:この実験では、CS(95 dB SPL)とUS(0.9 mA)を使用します。- 1 日目に、被験者をコンテキスト A で 5 つの CS 単独試験に曝露します。
- 2日目と3日目に、状況Bで5つのCS-US関連試験で被験者を条件付けます。
- 4 日目に、コンテキスト B のリコール セッションのために 5 つの CS 単独試験に被験者をさらします。記憶の消滅をテストする場合は、被験者を 15 回の CS 単独試験にさらします。
注:メモリの安定性をテストするには、消光セッションを2〜3日間延長すると役立ちます。また、4日目ではなく1週間後にメモリをテストすることで、メモリの安定性をさらに確認することができます。
4. 防御行動の分析
注:CSプレゼンテーション中のモーション、フリーズの割合、およびジャンプの回数が分析されます。詳細は以下で説明します。可能であれば、二重盲検法で分析する方が良いでしょう。
- ビデオに記録されたトーンの入口を使用して、ビデオ内のイベントのタイミングと刺激のタイミング(CSとUS)を同期させます。
- カスタムメイドのコードを利用して、フレーム間の被写体のシルエットの重心の違いに基づいて、マウスの平均運動と総運動の両方を計算します。
注:動きの速度は動画のサンプリングレートに依存するため、この測定には任意の単位が使用されます。 - 凍結率を測定するには、トランスデューサの信号を時間的に使用します。
- 20〜500Hzのバンドパスフィルターを使用してトランスデューサ信号を前処理します。
- 探触子信号の二乗平均平方根振幅を、50 msビンごとに時間的に計算します。
- 不動期間を検出するための信号振幅のしきい値を設定します。不動の持続時間は、1 秒以上、しきい値よりも低い信号期間です。
- ビデオを見て、凍結時間を手動で測定します。
- 手動で測定した凍結率とトランスデューサ信号から計算した割合を比較して、凍結の信号振幅の閾値を調整します。
- ビデオファイルから手動でジャンプの数を数えます。
注:ダーツの数を数えることは、飛行応答の評価にも役立ちます。
5. 統計解析
- p<0.05に統計的有意性を設定します。
- 複数のグループと複数の因子を比較するには、多元配置分散分析を実施し、その後に事後検定を実施します。コンディショニングスケジュールの特定の日をテストする場合は、多重比較テストまたは順列テストを実行します。
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Representative Results
雄マウス(C57BL/6J;生後3-6ヶ月)の修正恐怖条件付けで得られた結果を、 図1Cに示すスケジュールに従って提示する。この実験は、条件付けられた状況が飛行行動の表現にどのように影響するかを調べるために設計されました。グループ1(n = 10)とグループ2(n = 10)の2つのグループを割り当てました。この実験では、CS(95 dB SPL)とUS(0.9 mA)を使用しました。
1日目に、すべてのマウスを状況Aで5回の条件刺激(CS)単独試験に曝露した。これに続いて、すべてのマウスを、2日目と3日目にコンテキストBで5回のCS無条件刺激(US)試験で条件付けしました。4日目に、グループ1はコンテキストBでリコールセッションのCS単独試験を5回経験し、グループ2はコンテキストAでテストされました。
グループ1の被験者は、特に3日目と4日目のCSプレゼンテーション中に、ジャンプやショートダーティングなどの顕著な飛行行動を示しました( 図2A、Bを参照)。CSプレゼンテーション中の総運動数とジャンプ数の両方が、コンディショニングの進行とともに増加しました(図2A、B)。CS呈示中の凍結は2日目に増加し、その後の試験では比較的一定に保たれた(図2B)。被験者は、CSプレゼンテーションの開始時に高揚した動きを示し、CSプレゼンテーション全体を通して一貫して飛行行動を示しました(図2A)。
グループ2の被験者は、2日目と3日目にグループ1の被験者とほぼ同じ頑健な飛行行動を示しました( 図2Aを参照)。しかし、無条件の状況であった4日目の状況Bでは、グループ2の被験者はCSの提示中に飛行行動を示さなかった(図2A、B)。4日目のCS中の運動の比較では、グループ1はグループ2よりも有意に多くの運動量を持っていることが示されました( 図2Cを参照。G1 対G2, p = 0.014)です。さらに、4日目のCS中の凍結の比較では、2つのグループ間で統計的に有意な差が示されました( 図2Dを参照;順列検定;G1 対G2, p < 0.000)。4日目のジャンプに関しては、グループ1はグループ2よりも多くのジャンプを示しました( 図2Eを参照。G1 対G2, p = 0.034)です。これらの知見は、恐怖条件付け中の緊張によって引き起こされる逃走行動が文脈依存的であることを示唆している。
図1:修正された恐怖条件付け実験のデザイン。 (A)実験状況AとBの模式図を示す。(B)CSと米国のプレゼンテーションの構成。CSは8kHzの連続トーンバースト(20秒)で、US(フットショック、1秒)はCS終了直後に配信されました。試験間の間隔は60〜75秒でした。 (C)修正された恐怖条件付け実験のスケジュール。図はFuruyama et al.15から修正したものである。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:飛翔行動の表現に不可欠な文脈。 (A)CS呈示の前後の各条件の日別平均運動を示す。灰色の網掛けのピリオドはCSプレゼンテーションを表し、赤い線は米国のプレゼンテーションを示します。灰色の線は、各トレースの平均の標準誤差を示します。3日目には、G1とG2のCSプレゼンテーション中にモーションが増加しました。4日目には、G1のCSプレゼンテーション中にモーションが増加しました。(B、モーション)各試行の CS プレゼンテーション中の平均総運動がプロットされます。(B、凍結)各試行のCSプレゼンテーション中の凝固の平均パーセンテージがプロットされます。(B、ジャンプ)各試行の CS プレゼンテーション中の平均ジャンプがプロットされます。G1は、4日目のCSプレゼンテーション中にジャンプしました。(C)4日目の動きの比較。G1 は G2 よりも大きく移動しました。(D)4日目の凝固率の比較。G2はG1よりも凍結が多かった。(E)4日目のジャンプの総数の比較。G1はG2よりも大きくジャンプしました。横の赤いバーは平均を示し、縦の赤いバーはパネル(C-E)の各グループのSEMを示します。*p < 0.05 です。図はFuruyama et al.15から修正したものである。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この記事で紹介した修正された恐怖条件付けプロトコルは、恐怖の文脈での飛行行動を調査するための安定した方法です。このプロトコルを用いることで、恐怖の文脈におけるマウスの飛翔行動は、顕著な刺激によって引き起こされ、文脈に依存することを見出しました。飛行行動の特性は、飛行行動を観察するための適切なプロトコルがなかったため、十分に調査されていませんでした。このプロトコルは、恐怖の文脈で積極的な防御行動を研究するための適切な方法の1つになります。
最近では、現在のプロトコルに加えて、いくつかのプロトコルが導入されています。SCSによる数日間のコンディショニングは、マウスおよびラット10,11,12,13,14の手がかり提示中に飛行行動を安定的に誘導します。また、1日に7回のCS-USアソシエーションを繰り返すと、雌のラットは一種の飛翔行動であるダーティングを呈する9。これらのプロトコルは、今回紹介したプロトコルと同じで、すべて信頼性が高いものですが、本作を含むプロトコルには、各研究の目的に応じて長所と短所があります。例えば、被験者は、2つの連続刺激とそれに続く足のショックで構成されるSCSプレゼンテーションで脅威の近接性を推定することができる。飛行行動の発現に対するCS特徴の純粋な効果を調査することを目的とした研究の場合、SCSプロトコルは最適ではありません。しかし、SCSプロトコルでは、凍結と飛行の間の遷移は常に短い期間(20秒)で発生します。したがって、受動的防御行動から能動的防御行動への移行、またはその逆の移行に焦点を当てた研究には、SCSプロトコルが最適です。7回のCS-US連合を使用するプロトコルは、雄ラットの場合、いくつかの修正が必要ですが、雌ラットの積極的な防御行動の研究に最適です。
このプロトコルは、SCSの代わりに顕著な純音表示を使用します。したがって、このプロトコルは、飛行動作をトリガーするためのさまざまなCS(さまざまなエンベロープまたはランピング/ダンピングなどのトーン形状を持つトーン)の影響を調査するのに適しています。我々は、少なくともCS特性の1つであるトーン強度が、飛行行動の発現に決定的な影響を与えることを実証した15。次に、さまざまなCS機能が飛行挙動に異なる影響を与えることが予想されます。私たちのプロトコルの最も重要なポイントは、トーン刺激を提示するためのスピーカーのキャリブレーションです。多くの場合、恐怖条件付けボックス内の市販のスピーカーは十分に校正されておらず、パラメータは信頼できません。この実験には、微調整された信頼性の高いスピーカーを使用することを強くお勧めします。コンディショニング日数については、1日の試行回数を減らすことでトレーニング日数を延ばすことが可能です。例えば、今回紹介したプロトコルでは、1日5回の試験を2日間行うというスケジュールを採用しました。これの代わりに、1日4回、3日間試用することもできます。スケジュールは、各研究の目的に応じて変更される可能性があります。
最後に、これらのプロトコルで導入された能動的防御行動は、能動的回避(シャトル回避)実験で観察された能動的防御行動とは異なります。能動的回避中の逃走行動はより習慣的であり、一旦学習すると、被験者は逃げ続けます 3,16,17が、このプロトコルの飛行はパニック行動のように見え、被験者はCS 10,11,12,13,14,15に従っていないことに気づくと飛行行動を示さなくなります.また、これらのパニック様の逃走行動は、恐怖の文脈における舐め抑圧で報告された行動抑制とは区別される18,19が、どちらも恐怖誘発の防衛行動である。このようなパニックのような飛行行動は見過ごされ、十分に研究されていません。本プロトコルを含む新しいプロトコル9,10,11,12,13,14,15を用いることで、パニック行動の神経相関を解明する。
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Disclosures
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言します。
Acknowledgments
本研究の一部は、科研費助成金JP22K15795(T.F.宛)、JP22K09734(N.K.宛)、JP21K07489(R.Y.宛)、金沢医科大学(C2022-3, D2021-4、R.Y.宛)、内藤財団(T.F.)の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Audio speaker | Fostex | FT17H | |
| Amplifier | Sony | TA-F500 | |
| CMOS camera | Sanwa Supply Inc. | CMS-V43BK | |
| Fear conditioning chamber | Panlab S.L.U. | LE116 | |
| Food pellets | Nosan | Labo MR standard | |
| LED | Yamazen | LT-B05N | |
| Microphone | ACO | type 4156N | |
| Scramble shocker | Panlab S.L.U. | LE 100-26 | |
| Sound card | Behringer | UMC202 | |
| Sound software | Syntrillium Software | Cool Edit 2000 | |
| Transducer | Panlab S.L.U. | LE 111 |
References
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今月のJoVE第202号では、Erratum
Formal Correction: Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice
Posted by JoVE Editors on 05/17/2024.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice. The Abstract section was updated from:
The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active defensive behavior, such as jumping or rapid darting, is expressed under high threat imminence or actual threat, whereas passive defensive behavior, such as freezing, is expressed when the threat is predicted, but the threat imminence is relatively low. In classical fear conditioning, subjects typically exhibit freezing as a conditioned defensive response, with little expression of active defensive behavior in most cases. Here, we introduce a modified fear conditioning procedure for mice to observe the transition from freezing to flight and vice versa, involving five repetitive pairings of conditioned stimuli (CS; continuous tone, 8 kHz, 95 dB SPL (sound pressure levels)) and unconditioned stimuli (US; foot shock, 0.4 or 0.9 mA, 1.0 s) over two days. This modified fear conditioning procedure requires a relatively large number of conditioning sessions and conditioning days but does not necessitate a high-intensity foot shock for modest expression of flight behavior. Using the same context for conditioning and salient CS presentations is essential to elicit flight behaviors. This modified fear conditioning procedure is a reliable method for observing active defensive behaviors in mice, providing an opportunity to elucidate the fine mechanisms and characteristics of such behaviors in a fearful context.
to:
The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active defensive behavior, such as jumping or rapid darting, is expressed under high threat imminence or actual threat, whereas passive defensive behavior, such as freezing, is expressed when the threat is predicted, but the threat imminence is relatively low. In classical fear conditioning, subjects typically exhibit freezing as a conditioned defensive response, with little expression of active defensive behavior in most cases. Here, we introduce a modified fear conditioning procedure for mice to observe the transition from freezing to flight and vice versa, involving five repetitive pairings of conditioned stimuli (CS; continuous tone, 8 kHz, 95 dB SPL (sound pressure levels)) and unconditioned stimuli (US; foot shock, 0.9 mA, 1.0 s) over two days. This modified fear conditioning procedure requires a relatively large number of conditioning sessions and conditioning days but does not necessitate a high-intensity foot shock for modest expression of flight behavior. Using the same context for conditioning and salient CS presentations is essential to elicit flight behaviors. This modified fear conditioning procedure is a reliable method for observing active defensive behaviors in mice, providing an opportunity to elucidate the fine mechanisms and characteristics of such behaviors in a fearful context.
