In vivo Centrifugação de Embriões Drosophila

1) Preparando-se placas de ágar Resumo: Este protocolo emprega placas de ágar para dois usos distintos. Primeiro, as placas de agar servir como superfície de coleta de ovos; suco de maçã no agar estimula a postura de ovos. Em segundo lugar, os embriões embutido no agar são mantidos em uma orientação fixa, quando as placas são centrifugadas; uma concentração suficientemente elevado de agar é necessária para evitar que as placas se desintegrando durante a centrifugação. Para simplificar, um único tipo de ágar suco de maçã é empregada para ambas as utilizações. Materiais Agar (25 g) Sacarose (25 g) Suco de maçã (250 ml) Nipagin M solução estoque (5 g Metil-p-hidroxi-benzoato em 50 ml de etanol), age como um conservante Placas de Petri: por centrifugação (60x15mm) e para coleta de ovos (60×15 mm ou 100×15, dependendo da gaiolas fly usado na etapa 2) Equipamento Chapa elétrica Dois frascos Erlenmeyer Num Erlenmeyer, combine 25 g de ágar e 750 ml dH 2 O. Autoclave por 50 min no ciclo líquido. Nesse meio tempo, prepare o suco de maçã solução (passo 1.2). Em outro erlenmeyer, combine 25 g de sacarose e 250 ml de suco de maçã. Calor em chapa quente (a cerca de 55 ° C) para dissolver a sacarose. Em seguida, adicione 15 ml de solução M Nipagin. Evite temperaturas mais elevadas, como eles vão causar Nipagin a quebrar. Uma vez que a solução agar esfriou o suficiente para que o frasco pode ser manuseado com as mãos, misture as duas soluções e misture bem. Mexa no prato quente até uniformemente misturado. Despeje solução em placas de Petri (~ 0,5 cm de altura). 1 litro de solução é suficiente para cerca de 100 pequenos (60 mm de diâmetro) ou 40 grandes (100 mm de diâmetro) pratos. Placas de ágar deve secar por várias horas ou durante a noite à temperatura ambiente, caso contrário, serão muito molhado para uso. Para armazenamento a longo prazo, mantê-los envolvidos (em caixas de plástico ou mangas placa de Petri) a 4 ° C. 2) A colheita de embriões Resumo: Durante as primeiras três horas de desenvolvimento (em temperatura ambiente), os embriões são células Drosophila simples (sem contar os precursores de células germinativas, as células do pólo posterior localizada). Quando os embriões devidamente orientado destes estágios são centrifugadas, as organelas grandes separados por densidade ao longo do eixo do ovo. Na fase celularização, esta célula única grande é convertida em milhares de pequenas células, a força centrífuga empregada não ruptura dessas células. Para a segregação de sucesso de organelas grandes, portanto, é fundamental para centrífuga embriões que ainda não tenham completado celularização. Materiais Ágar suco de maçã placas Colar levedura (fermento biológico seco misturado com água para a consistência de manteiga de amendoim) Equipamento Fly gaiolas: comercialmente disponíveis (veja abaixo) ou um home-made Moscas adultas são mantidos em gaiolas em que placas de ágar suco de maçã estão afixadas na parte inferior. Use um tamanho de pratos de Petri apropriado para as gaiolas em uso. Para iniciar uma coleta de ovos, prepare uma nova placa de ágar suco de maçã e cobrir uma parte com pasta de levedura. Moscas de fruta comer levedura, em especial, a levedura fornece nutrição para produção de ovos. A presença de leveduras e suco de maçã no agar também induz postura de ovos. Para trocar o velho com o novo prato de agar, a gaiola é voar invertido e bateu em cima do banco algumas vezes. As moscas vão cair para o fundo e são brevemente desorientado. Que lhe dá alguns segundos para remover rapidamente uma placa de agar e substituí-la por uma nova. Esta troca tem alguma prática, e os detalhes dependem do tipo de gaiola utilizada. Feminino moscas esperma de acasalamentos anteriores loja em bolsas internas (espermatecas) a partir do qual o esperma é liberado para permitir que a fertilização de ovos. Quando bem alimentado e tranqüilo, as fêmeas põem ovos logo após a fertilização e, portanto, o tempo de postura marca o momento da fecundação eo início do desenvolvimento. Quando as condições não são ideais, as fêmeas os ovos fertilizados para tempos variáveis ​​antes de colocar. Para minimizar o número de tal mis-encenado embriões, é aconselhável descartar a primeira coleção do dia de trabalho (uma "coleção de pré-" de 30 a 60 min é suficiente). A presença do fermento fresco induz as fêmeas para colocar esses ovos realizada, e as coleções de ovos subseqüentes tendem a ser dominadas por ovos depositados logo após a fertilização. Coleta de ovos para até 3 horas, dependendo de qual estágio embrionário é desejada. Desde a celularização temperatura ambiente for concluída após aproximadamente 3,5 horas, coleta de vezes mais não são úteis. Camadas mais consistente é alcançada em embriões jovens, assim, para experimentos de rotina, favor tempos mais curtos de coleta (1 hrou menos). Às vezes, as moscas ficam presas à levedura ou para a superfície da placa de ágar. Removê-los com pinças. 3) Retirar a casca do ovo dos embriões Resumo: embriões Drosophila são cobertos por duas camadas de proteção: uma camada externa (córion) feito de proteína e uma camada interna (membrana vitelina) predominantemente feitas de cera. Eles protegem o embrião contra os insultos mecânicos e dessecação. O córion possui duas extensões (os filamentos ovo ou apêndices dorsal) que são facilmente visíveis como estruturas distintas. Nesta etapa, iremos remover o córion por imersão dos ovos em água sanitária a 50%. Uma vez que o córion é removida, o embrião torna-se transparente à luz transmitida, permitindo a seleção de determinados estágios embrionários de centrifugação. Como o córion também interfere com muitos pós-centrifugação procedimentos (por exemplo, a fixação na etapa 6), a remoção do córion agora vai permitir um processamento rápido depois. O tratamento lixívia 50% vai dissolver o córion em poucos minutos, no entanto, não prejudica o embrião. A membrana vitelina mantém fora lixívia. Vamos continuar o tratamento até que a água sanitária filamentos de ovos não são mais visíveis. Depois, vamos separar os embriões a partir da lixívia, derramando a suspensão do embrião / lixívia por uma peneira pequena (um cesto feito de malha de arame). É fundamental não se apressar o passo exposição lixívia. Se a água sanitária é lavado prematuramente, etapas posteriores (por exemplo, a remoção da fixação membrana vitelina seguinte) pode ficar comprometida. Materiais: Garrafa de esguicho com água sanitária a 50% (um volume de dH 2 O para um volume de água sanitária comercial) Garrafa de esguicho com dH 2 O Toalha de papel Equipamento: Cestas de arame caseiros feitos de folhas de malha de fio de aço inoxidável. Para fazer cestos, corte quadrados de aproximadamente 2 x 2 cm para fora da folha plana e travessão-los no meio. Pinças para segurar cestas de arame Microscópio de dissecação configurado para transiluminação Coloque a placa de agar sob um microscópio de dissecação e observar os embriões por transiluminação. Certifique-se de identificar os filamentos de ovos (ver Figura 2A). Bleach Squirt 50% para a placa de agar, cobrindo os embriões. Agitar a placa de ágar, ocasionalmente, a girar em torno dos embriões na lixívia. Uma vez que os filamentos de ovos não são mais visíveis (geralmente depois de 3-5 min, mas o horário pode variar), o córion foi removido com sucesso. Na próxima etapa, uma cesta de tela de arame será usado como peneira para separar os embriões a partir da lixívia. Agarrar a cesta de arame com pinças e segurá-la sobre a tampa invertida de placa de agar. A tampa vai servir de reservatório para pegar o bleach gotejamento através da malha de arame. Despeje a polpa de lixívia / embrião a partir da placa de ágar através da malha de arame. Se um número significativo de embriões permanecem na placa de agar, squirt dH 2 O na placa e despeje a pasta dH 2 O / embrião através da malha de arame. Se um número significativo de embriões transbordar para o reservatório, despeje o conteúdo do reservatório através da malha de arame. Tocar o fundo da tela de arame para uma toalha de papel para blot fora qualquer excesso de líquido. Então esguicho dH 2 O para a malha de arame para enxaguar lixiva. Como descrito acima, a placa de cobertura pode ser usado como reservatório para recuperar qualquer embriões acidentalmente lavado. Você pode minimizar a perda de embriões, apontando o fluxo de água da garrafa de esguicho ao longo do perímetro da cesta de arame. Freqüentemente blot fora o excesso de líquido. Repita esta etapa de lavagem cinco a dez vezes, até que todos os lixívia foi removido. Se a cesta de arame ainda tem cheiro de água sanitária, lavagem deve continuar. Embriões 4) Montagem em agar Resumo: ovos de Drosophila são muito mais longos (~ 500 mm) do que larga (~ 180 mm). Para obter a separação máxima e consistente de organelas durante a centrifugação, que embriões orientar tal que seu ponto anterior termina em direção ao centro de rotação (Figura 1, 3). Dessa forma, o mais leve estruturas intracelulares (gotículas lipídicas) acumulam na extremidade anterior em todos os embriões, enquanto as estruturas muito densas (componentes gema) se acumulam perto da extremidade posterior. Embriões são inseridas em pequenos furos verticais em ágar suco de maçã, com as extremidades anterior apontando para cima. O agar mantém o embrião de uma orientação fixa durante a centrifugação. Equipamento: Porta agulha Agulhas de tungstênio; as agulhas são montados no suporte para trás a partir da orientação típica, de modo que a extremidade sem corte se destaca e está disponível para manipular os embriões P200 pipetador Microscópio de dissecação configurado para transillumination Fly pincel (pequeno pincel usado para classificar adulto Drosophila) Materiais: Triton solução salina (TSS): 4g de NaCl, 0,3 ml Triton X-100, preencha com DDH 2 O a 1000 ml (pode ser feita como uma solução estoque 10x) Lavar os embriões do cesto de arame com TSS e em uma placa de Petri vazia. Os embriões devem desviar para o fundo. Transferir a placa de Petri contendo os embriões no TSS em um escopo dissecar e observar por transiluminação (embriões será semelhante aos retratados na Figura 4). Usando um pipetador P200, selecionar embriões de estágios desejado e transferi-los para uma placa de agar de pequeno porte. Estágios específicos podem ser facilmente reconhecido visualmente (Figura 4; para mais detalhes, veja 1). Trabalhar rapidamente, pois os embriões são o envelhecimento ea submersão prolongada (mais de 30 min) em TSS pode afetar o desenvolvimento. Remover a maioria dos TSS com uma pipeta e uma Kimwipe. A superfície do ágar deve ser ligeiramente úmido que torna mais fácil a empurrar em torno de embriões. No entanto, não deve haver poças de líquido restante em qualquer lugar do prato, o excesso de líquido durante a centrifugação fará com que os embriões a deslizar para fora dos buracos. Usando uma agulha, faça vários furos verticais no agar perto onde quer que um embrião está localizado. É difícil criar buracos que são perfeitamente vertical porque você tem que segurar a agulha em um ângulo para ser capaz de, simultaneamente, assistir ao microscópio. Uma inclinação menor da agulha é realmente vantajoso, pois isso cria uma depressão leve / bosque de um lado do buraco para que o embrião irá deslizar facilmente ao longo dela e no buraco. É suficiente para perfurar a superfície do agar agar é desde o suave o suficiente para que uma vez um embrião é parcialmente inserido em um buraco que pode ser empurrado para dentro ainda sem danos. Certifique-se de reconhecer as extremidades anterior e posterior dos embriões, como os embriões devem ser empurrados para os buracos em uma orientação coerente, tipicamente com a extremidade anterior para cima. A membrana vitelina na extremidade anterior é caracterizada por uma estrutura especializada, a micrópila (Figura 2), através do qual o espermatozóide entra durante a fertilização. Usando o fim brusco da agulha, você pode empurrar o embrião para movê-lo ao longo do agar e orientar / manobra sua extremidade posterior em direção a um buraco perfurado. Em seguida, empurre contra a extremidade anterior para o buraco. Isto deve deslizar facilmente o embrião para dentro do buraco ao longo da depressão leve gerados durante a perfuração. Como o embrião está inclinado para cima, empurre-o mais para dentro do buraco. Quando totalmente pressionado, o embrião é normalmente já bastante vertical. Se não, você pode alinhar o embrião inserido mais verticalmente, empurrando-la lateralmente. Se o buraco não é grande demais, a posição do embrião será realizada de maneira estável pelo agar durante a centrifugação. Com a prática, é possível incorporar 100-250 embriões por placa. Vai depender da aplicação em particular sobre quantos são necessários: Se os embriões são usados ​​para geração de imagens ao vivo ou como doadores para transplante de experimentos, apenas alguns são obrigatórios. Se os embriões devem ser fixos e imunocoradas, uma fração serão perdidos durante o processamento pós-centrifugação, e um tem que começar com números mais altos. Tenha em mente que os embriões continuam a desenvolver durante a montagem assim, se uma fase de desenvolvimento estreita é desejado, o tempo total para as necessidades de montagem para ser curto. Se houver alguma sobra de embriões que não foram incorporados, removê-los da placa com um pincel umedecido voar. Mergulhar o pincel voar em líquido (1xTSS por exemplo), limpar cuidadosamente toda a parte superior da placa (enquanto assiste no âmbito de dissecação) para varrer qualquer embriões excedentes, e lavar os embriões fora do pincel por imersão a escova em líquido novamente. 5 centrifugação) e recuperação de embriões Resumo: As placas são transferidas para baldes balançando de um Sorvall RT7 Além disso centrífuga e centrifugado por 30 min a 4000 rpm, o que corresponde a ~ 3000 g. Após a centrifugação, as placas são cobertas com TSS. Com uma agulha, os embriões são escavadas na buracos no agar e transferidos para recipientes apropriados através de uma pipeta. Equipamento: Agulha titular com agulha (como antes) Sorvall RT7 Plus com RTH750 rotor e baldes de balanço, ou equivalente 2 Microscópio de dissecação configurado para transiluminação P200 pipetador Materiais: TSS Transferência de placas de baldes balançando do lado de agar centrífuga, para baixo. Certifique-se de centrífuga é equilibrada. Definições para centrifugação: temperatura = 40-10 ° C, rpm = 4000 tempo = 30 min. Após a centrifugação placa de ágar, coloque sob o microscópio de dissecação novamente e cobrir a placa com uma camada de TSS. Usando o blunt final da agulha, cavar os embriões retirados de seus buracos. Eles vão flutuar em TSS, mas vai ficar submerso. Embriões, obviamente, vai aparecer em camadas, com um boné marrom na extremidade anterior, uma região média clara, e uma área cinza escuro na extremidade posterior (Figura 2, 5A). Descartar embriões que não mostram camadas distintas. Usando um pipetador P200, a transferência dos embriões bem-camadas em TSS para uma nova embarcação, por exemplo, um frasco de cintilação ou tubo de microcentrífuga, dependendo da aplicação. 6) O tratamento posterior Dependendo da aplicação, os embriões serão posteriormente tratados de várias maneiras. Para observação direta por microscopia de campo brilhante ou de epifluorescência, os embriões são transferidos em buffer para uma lâmina de vidro, e montado sob um milímetro 22×22 # 1,5 lamela, com 18×18 milímetros # 1 lamínulas como espaçadores. Para observações a longo prazo, pode ser necessário substituir o amortecedor com óleo halocarbono 27. Se os embriões devem ser fixados, eles devem ser transferidos no passo 5,6 para um frasco de cintilação. Eles podem ser corrigidos através de técnicas de fixação padrão 1. Estas técnicas normalmente empregam agitação em uma emulsão de metanol heptano para remover a membrana vitelina. Note que para embriões centrifugado a eficiência desta etapa devitellinization é baixa. Portanto, é aconselhável começar com embriões como muitos como prática ou para remover a membrana vitelina manualmente 1. Se os embriões serão usadas em experimentos de transplante (por exemplo, para remover uma camada organela especial dos embriões centrifugado), eles são transferidos para placas de ágar e montadas em lamínulas, utilizando os procedimentos padrão, como para os embriões uncentrifuged 3. As camadas induzida por centrifugação é estável durante dezenas de minutos. 7) Os resultados representativos Se a centrifugação funcionou conforme o esperado, as organelas importantes embrionárias vai resolver por densidade 2. Por exemplo, as gotículas de lipídios de baixa densidade irá acumular no fim anterior; as vesículas de alta densidade gema irá acumular no fim posterior (Figura 1, 2). Gotículas lipídicas e vesículas gema são organelas de armazenamento de lipídios e proteínas. Confirmação da densidade-dependente estratificação é obtida através de inspeção visual dos embriões vivos por transiluminação sob um microscópio de dissecação ou compostos. Os embriões devem aparecer como na Figura 5A: O gotículas lipídicas irá formar uma camada sólida marrom na ponta anterior (a "tampa de lipídios"); acumulação gema irá resultar em uma zona cinza escuro no final posterior. Essas duas camadas escuras são separadas por uma zona ampla claro que representa outras organelas e citoplasma. Se os embriões são centrifugadas após a celularização, layering será mínima (Figura 5C). Se um microscópio de epifluorescência, está disponível, estes vivos, embriões centrifugado podem ser examinados sob excitação UV. Sob essas condições, a gema apresenta autofluorescência azul intenso (Figura 5B). A camada compacta de material autofluorescent no pólo posterior centrifugação indica sucesso e serve como um marcador para o fim posterior. Note-se que o aparecimento dessas camadas irá mudar drasticamente se os embriões são fixos. Por exemplo, quando os embriões são fixadas pela fixação de calor ou formaldeído padrão seguido pelo metanol-heptano devitellinization 1, gotículas lipídicas e tornam-se translúcidas a camada lipídica aparece esbranquiçado e fofo por brilhante luz de microscopia, em vez de marrom escuro (Figura 5D). Gema de autofluorescência é parcialmente ou completamente destruída por fixação, tornando-se muito menos intensa ou até mesmo indetectável. Se in-vivo de centrifugação é empregada para realçar uma organela particular, é útil etiqueta que organela com um marcador fluorescente para confirmação. Por exemplo, proteínas de fusão YFP alvejado a mitocôndria, a ER ou o Golgi foram descritos 4. Em embriões de centrifugado, estes marcadores se acumulam em posições características ao longo do eixo ântero-posterior (Figura 1). Finalmente, certas proteínas de fusão histona localizar tanto para gotículas lipídicas e núcleos 2, e, portanto, podem ser usados ​​para marcar esses compartimentos celulares (Figura 5 E, F), bem como para monitorar o estágio do embrião (pelo número de núcleos marcados) . Cepas Fly expressando os marcadores mencionados neste parágrafo estão disponíveis na Drosophila Bloomington estoque centro (http://flystocks.bio.indiana.edu/). Para H2Av histonas, duas variantes, GFP e MRFP estão disponíveis 5, 6 Figura 1. Separação de organelas por centrifugação (modificado após 2). Centrifugação de embriões orientada para os resultados distintos na estratificação(Luz forte). Organelas grandes acumulam em posições características ao longo do anterior (até) – eixo (baixo) posterior: gotículas lipídicas (detectado em embriões fixado pelo Nilo coloração vermelho); retículo endoplasmático, Golgi e mitocôndrias (detectado em embriões vivos através dos marcadores YFP descrito no o texto principal); gema (detectada por autofluorescência). As imagens de fluorescência foram adquiridas por microscopia confocal. Figura 2. Representação esquemática de embriões. A. Ovo com casca de ovo e os filamentos de ovo proeminente (apêndices dorsal). Como a casca do ovo não é translúcido, o ovo aparece uniformemente escura. B. Egg com o cório removido. No final anterior (esquerda), a micrópila é visível. Dependendo do estágio de desenvolvimento, o embrião dentro da membrana vitelina aparecerá uniformemente marrom escuro ou mostrar várias estruturas. Ver Figura 4 para exemplos. C. Centrifugados embrião, orientado como no protocolo aqui descrito. Gotículas lipídicas acumulam como um "cap" marrom no final micrópila; gema forma uma camada de cinza ou perto da extremidade oposta. Figura 3. Descrição esquemática do procedimento. Esquerda: Embriões sem córion são colocados em cima de uma placa de agar e empurrou com uma agulha nos orifícios no ágar. Esta montagem resulta em uma orientação consistente de todos os embriões, com a anterior acaba. Direita: Após a centrifugação, os embriões são estratificadas. Agar é sobreposto com TSS (azul), e os embriões são recuperados a partir do ágar com a agulha. Uma vez suspenso em TSS, os embriões podem ser apanhados com uma pipeta. Figura 4. Bright-luz imagens de embriões vivos Drosophila, semelhante à forma como eles irão aparecer no passo 4.1. Embriões são mostrados na orientação padrão: extremidade anterior até o fim, posterior esquerda para a direita até lateral, dorsal, ventral e lateral para baixo. Um filme de lapso de tempo de embriogênese precoce é disponível como parte do vídeo que acompanha este protocolo. Embriões em estágio A. Cleavage aspecto uniformemente castanho. Estágios como este são ideais para in-vivo centrifugação. Embriões Blastoderma B. têm um aro claro que é semelhante em todos os lados. Este periferia claro é em parte devido ao acúmulo de núcleos na membrana plasmática e, em parte devido ao transporte dentro de vesículas gema e gotículas lipídicas 7. Este periferia claro se expande até perto do final da celularização 1. Embriões podem ainda ser sucesso estratificada por centrifugação até o final do celularização 8, embora camadas de gema e núcleos não é tão consistente como nos estágios de clivagem. C. Após celularização, embriões aparecem assimétricos; lados dorsal e ventral se tornar distinto, e várias dobras desenvolver. O embrião é mostrado em extensão germe banda cedo. Nesses estágios, a centrifugação não é mais eficaz na estratificação dos principais organelas. Figura 5. Embriões Centrifugados. Todos os embriões nesta figura foram centrifugadas com sua extremidade anterior para cima e são mostrados em que a orientação. A. imagem Bright-luz de um embrião com sucesso centrifugado. Uma camada marrom no final anterior é devido ao acúmulo de lipídios-gota. Uma ampla camada cinza perto da extremidade posterior é devido a vesículas gema. Há freqüentemente uma zona clara abaixo da camada de gema, de origem desconhecida. Uma zona amarelada é muitas vezes aparente acima da camada de gema, que provavelmente representa mitocôndrias. Proteínas solúveis são encontradas ao longo da camada clara entre gotículas lipídicas e gema 2. B. O embrião em A visualizada por microscopia de epifluorescência, sob excitação UV. A característica azul autofluorescência de gema ajuda a identificar a extremidade posterior. Embrião C. centrifugadas durante germe banda de extensão, ou seja, após a celularização. Gema ainda pode se acumular na parte posterior, mas de outra forma de camadas é mínimo. D. embrião com sucesso estratificada, após a fixação de calor. A camada lipídica gota-aparece em branco e macio, ao invés de castanho escuro, em embriões unfixed (A). E. & F. Os embriões expressar His2Av-GFP e fotografada por microscopia confocal (modificado após 2). E: centrifugado a estágios de clivagem; His2Av-GFP parece só marca a camada de gotículas desde poucos núcleos são formados por esta altura. Dependendo do plano focal, os núcleos podem ser visíveis apenas sob a camada de gotículas (não mostrado aqui). F: centrifugado em estágios blastoderma; His2Av-GFP marca tanto a camada lipídica de gota (em cima) e núcleos (em uma zona ampla abaixo da camada de gotículas).