ショウジョウバエの胚の生体内の遠心

1）寒天プレートの準備 概要：このプロトコルは、二つの異なる用途に寒天プレートを採用。最初に、寒天プレートには、採卵の面として、寒天のりんごジ​​ュースは、産卵を刺激する。プレートを遠心分離しているときに2番目、寒天に埋め込まれた胚は、一定の方向に保持​​され、寒天の十分に高い濃度では、遠心分離中に崩壊からプレートを防止するために必要です。わかりやすくするために、リンゴジュース寒天のシングルタイプは、両方の用途に採用されている。 材料寒天（25 g）をショ糖（25g）をアップルジュース（250 ml）を Nipagin Mのストック溶液（50mlのエタノールに5グラムメチル- p -ヒドロキシ安息香酸）は、防腐剤として機能しペトリ皿：遠心分離（60x15mm）用と採卵用（60×15 mmまたは100×15 mmの手順2で使用したフライケージに応じて） 機器ホットプレート二つの三角フラスコ三角フラスコに、25gの寒天と750ミリリットルのdH 2 Oを組み合わせる液体サイクルで50分間オートクレーブ。その間に、リンゴジュースのソリューション（ステップ1.2）準備。 別の三角フラスコに、25gのショ糖とリンゴジュース250mlのを組み合わせる。ショ糖を溶解するために、ホットプレート上に熱（約55℃）。その後、15ミリリットルNipagin M溶液を加える。彼らはNipaginが破壊してしまうと、高温を避けてください。 寒天溶液がフラスコを手で扱うことができることが十分に冷却されると、2つのソリューションを組み合わせて、よく混ぜます。均一に混合されるまでホットプレート上でかき混ぜる。 ペトリ皿（約0.5センチの高さ）にソリューションを注ぐ。溶液1リットルは十分な約100の小さな（直径60mm）または40大型（直径100mm）料理用です。 寒天プレートは室温で数時間または一晩乾燥させてください、それ以外の場合は使用するためにあまりにもウェットになります。長期保存のために、4℃（プラスチックのビンやシャーレの袖で）それらをラップしてください℃に 2）収穫の胚 概要：開発の最初の3時間の間には、（室温で）、 ショウジョウバエの胚では、単一の細胞（生殖系列の前駆体、後方に位置する極細胞はカウントしません）です。これらの段階の適切な方向に胚は卵の長軸に沿って、密度によって別々の主要なオルガネラを遠心分離している場合。細胞化の段階では、この大規模な単一のセルは、小さな細胞の数千に変換され、遠心力は、破裂、これらの細胞をしません採用。主要な細胞小器官の正常な分離のために、それはまだ細胞化を完了していない胚を遠心分離することが重要です。 材料リンゴジュース寒天プレート酵母ペースト（ピーナッツバターの一貫性に水と混合した乾燥酵母） 機器市販の（下記参照）または1自家製：ケージを飛ぶ大人のハエは、リンゴジュース寒天プレート下部に貼付されているためケージに保管されています。使用中のケージに適したペトリ皿のサイズを使用してください。 卵のコレクションを開始するには、新鮮なリンゴジュース寒天プレートを準備し、酵母ペーストで部分をカバーしています。ショウジョウバエは、酵母を食べる、特に、酵母は、卵の生産のための栄養を提供します。寒天の酵母とリンゴジュースの存在は、また産卵を誘発する。 新しい寒天プレートで古いを交換するには、フライケージが反転し、ベンチの上に数回を打ちましたている。ハエが底に落ちるだろうと簡単に頭が混乱しているされています。それはグイッ寒天プレートを取り外すと、新鮮なものと交換するためにあなたに数秒を与える。この交換は、いくつかの練習を取り、その詳細は、採用ケージの種類によって異なります。 女性は精子が卵子の受精を可能にするために放出される内部のパウチ内の前の交配（spermathecaの複数形）から店舗の精子を飛ぶ。よく供給し、邪魔されないときは、女性は間もなく受精後の卵を産むため、産卵の時には、受精と発展の始まりの時間をマーク。条件が最適でないときは、メスが産卵前に変数回受精卵を保持する。このようなミス段階胚の数を最​​小限に抑えるために、それは平日の最初のコレクション（30〜60分の"プレコレクション"で十分です）を破棄することをお勧めします。新鮮な酵母の存在は、これらの保留産卵のために女性を誘導し、及びその後の卵のコレクションは、卵によって支配される傾向にある受精直後に堆積した。 胚のステージが望まれるに応じて、最大3時間のための卵を集める。室温の細胞化で〜3.5​​時間後に完了されているので、長い収集時間は有用ではありません。最も一貫性のある階層化は、そのルーチンの実験のために我々は（1時間の短いコレクションの時間を好む、若い胚で達成されるまたは以下）。 時々、ハエ、酵母、または寒天プレートの表面に立ち往生する。ピンセットでそれらを削除します。 3）胚から卵の殻を削除 概要：主にワックスで作られた蛋白質と内側の層からなる外層（絨毛膜）（卵黄膜）： ショウジョウバエの胚は2つの保護層で覆われている。彼らは機械的な侮辱と乾燥に対する胚を保護する。絨毛膜は、異なる構造として簡単に表示されている二つの拡張子（卵のフィラメントまたは背付属）を備えています。このステップでは、我々は50％の漂白剤で卵を浸して絨毛膜が削除されます。絨毛膜が取り除かれた後、胚は、遠心分離のための特定胚の段階を選択できるように、透過光で透明になります。絨毛膜はまた、多くの後遠心分離の手順（例えば、ステップ6で固定）を妨げるとして、絨毛膜の除去は、現在、迅速な処理後にできるようになります。 50％の漂白剤の治療は数分以内に絨毛膜を溶解します、まだそれが胚に悪影響を及ぼすことはありません。卵黄膜は、漂白剤を保ちます。卵のフィラメントが表示されなくなるまで我々は、漂白剤治療を継続します。その後、我々は小さなふるい（ワイヤーメッシュ製バスケット）を通じて胚/漂白剤スラリーを注ぐことによって、漂白剤からの胚を分離します。それは漂白剤露光工程を急いでしないことが重要です。漂白剤は、後の手順（例えば、卵黄膜の以下の固定の除去）が漏洩した可能性がある、途中で洗い流されていない場合。 材料： 50％の漂白剤と噴霧ボトル（一冊市販の漂白への1つのボリュームのdH 2 O） のdH 2 Oを持つ噴霧ボトルペーパータオル設備： ステンレススチールワイヤーメッシュのシートで作られた手作りのワイヤーバスケット。バスケットを作るために、平らなシートのうち2 × 2cmの正方形をカットし、途中でそれらをインデント。 ワイヤーバスケットを保持するピンセット解剖顕微鏡は、透視用に設定解剖顕微鏡の下に寒天プレートを配置し、透視によって胚を観察。 （図2Aを参照）卵のフィラメントを識別することを確認してください。 寒天プレート上に噴出50％の漂白剤、胚をカバーする。漂白剤の周り渦胚をするために時折寒天プレートを振とうする。 卵のフィラメントが（通​​常は3〜5分後に、しかし時間が異なる場合があります）認識できなくなっていると、絨毛膜が正常に削除されました。 次のステップでは、ワイヤーメッシュバスケットは、漂白剤から胚を分離するためにふるいとして使用されます。ピンセットでワイヤーバスケットを取得し、寒天プレートの反転カバーの上に保持する。カバーは​​ワイヤーメッシュを介して滴下漂白剤をキャッチするために貯水池として機能します。 金網を通して、寒天プレートから漂白剤/胚スラリーを注ぐ。 胚のかなりの数のプレートに寒天プレート、噴出のdH 2 Oに残り、金網を通してのdH 2 O /胚のスラリーを注ぐ場合。胚のかなりの数がリザーバーに波及した場合、ワイヤーメッシュを介してタンクの中身を注ぐ。 余分な液体を離れてしみにペーパータオルに金網の底部をタッチ。その後、ホヤのdH 2 Oには、ワイヤーメッシュの上に残っている漂白剤を洗い流すために。上述したように、カバープレートは、誤ってオフに洗浄どんな胚を回収するタンクとして使用することができます。あなたはワイヤーバスケットの周囲に沿って噴出ボトルからの水の流れを指すことにより胚を失う最小限に抑えることができます。頻繁に余分な液体をオフ汚点。 すべての漂白剤が除去されるまで、この洗浄工程を5〜10倍を繰り返します。ワイヤーバスケットはまだ漂白剤の匂いがする場合、洗浄は継続すべきである。 寒天4）取付胚 概要： ショウジョウバエの卵は、はるかに長い（〜500μm）の広い（〜180μm）よりもです。遠心操作中に細胞小器官の最大と一貫性のある分離を得るために、我々東洋の胚ように回転の中心に向かって自分の前方の端の点（図1,3）。非常に密な構造は、（卵黄成分）後端付近に蓄積しながらその方法は、軽い細胞内構造（脂肪滴）は、すべての胚の前端に蓄積。胚は、前方端が上付着して、リンゴジュース寒天の小さな縦の穴に挿入されます。寒天は、遠心操作中に一定の方向に胚を保持します。 設備： 針のホルダータングステン針、針は、平滑末端が突出して胚を操作するために使用できるように、典型的な方向から逆方向にホルダーに取り付けられている P200ピペッター transilluminatio用に設定された解剖顕微鏡N ブラシをフライ（大人ショウジョウバエのソートに使用する小型のペイントブラシ） 材料： トリトン塩溶液（TSS）：4グラムのNaCl、0.3ミリリットルトリトンX – 100、（10 ×ストック溶液として行うことができます）1000mlにのddH 2 Oで埋める TSSで、空のシャーレにワイヤーバスケットの胚を洗浄する。胚は、底に沈むはず。解剖スコープにTSSの胚を含むペトリ皿に移し、（胚は、図4に示すもののようになります）透視による観察。 P200ピペッターを使用して、希望のステージの胚を選択して、小さな寒天プレートに移す。特定のステージは簡単に（;詳細については、1を参照して図4）視覚的に認識することができます。胚は、TSSの老化と（30分以上）に浸して長時間しているので、すぐに仕事は開発に影響を及ぼす可能性があります。 ピペットとキムワイプで最もTSSを削除します。寒天の表面は、簡単に周りの胚をプッシュするようになっているわずかに湿ったでなければなりません。遠心分離中に余分な液は、胚が穴の外にスライドしてしまうしかし、プレート上の任意の場所に残っている液体のプールがあってはならない。 針を用いて、胚が配置されているすべての場所の近くに寒天に垂直の穴を突く。それは、同時に顕微鏡下で見ることができるように角度で針を保持する必要があるため完全に垂直に穴を突くのは難しいです。胚は、簡単にそれに沿って穴にスライドするように、これは穴の片側に若干のうつ病/グローブを作成するため、針のマイナーな傾きは実際に有利である。寒天は、胚の一部が穴に挿入されると、それがダメージを与えることなく、さらににプッシュすることができるくらいソフトなので、それは寒天の表面に穿刺には十分です。 胚は、通常、前端の上で、一貫性のある方向の穴にプッシュする必要があるように、胚の前部と後部の端を認識することを確認してください。前端における卵黄膜は精子が受精時に入るに経由する特殊な構造、卵門（図2）、によって特徴づけられる。 針の平滑末端を使用して、寒天に沿って移動し、配向させる/パンクした穴に向かって、その後端を操縦する胚に対してプッシュすることができます。その後、穴に向かって前端に対して立ち向かい。これは、簡単にパンクチャリング中に生成されたわずかなうつ病に沿って穴に胚を滑空してください。胚が上に傾くように、穴をより深くダウンに押し込みます。 完全に押し込まれたときに、胚はすでに通常かなり垂直です。そうでなければ、横ばい、それを押すことで、より垂直に挿入された胚を整列することができます。穴が大きすぎるではない場合、胚の位置が安定して遠心分離を通じて寒天で開催されます。 練習すれば、それは、プレート当たり100から250までの胚を埋め込むことが可能です。それはどれだけ必要とされる特定のアプリケーションに依存します：胚がライブイメージング用または移植の実験のためのドナーとして使用されている場合は、ほんの数が必要です。胚が固定され、免疫染色する場合は、画分を後遠心分離処理中に失われ、もう一方はより高い数字で始まる必要がありますされます。胚が狭い開発段階が所望される場合、取り付けのニーズの全体的な時間が短く維持されるので、実装時の開発を継続することに留意してください。 埋め込まれていない任意の胚の残りがある場合は、湿らせたフライブラシでプレートからそれらを削除する。 、残った胚を掃引し、再び液体にブラシを浸漬することによりブラシの胚を洗い流すためにプレートの上部（解剖範囲で見ている間）を越えワイプ慎重に、液体（例えば1xTSS）にフライのブラシを浸します。 5）遠心分離し、胚の回収 概要：プレートは、ソーバルRT7プラス遠心機のスイングバケットに転送し、〜3000 gに対応して4000rpmで30分間遠心分離されています遠心分離後、プレートをTSSで覆われている。針で、胚は、寒天の穴に掘られており、ピペットを介して適切な容器に移した。 設備： 針と針ホルダー（前と同じ） ソーバルRT7 RTH750ローターとスイングバケット付きプラス、または2と同等解剖顕微鏡は、透視用に設定 P200ピペッター材料： TSS ダウン遠心分離、寒天側のスイングバケットにプレートを転送します。遠心機が均等に分散されていることを確認します。 遠心分離のための設定：温度= 40〜10 ° C、回転数= 4000、時間= 30分。 もう一度解剖顕微鏡下で遠心分離、場所の寒天プレートの後とTSSの層でプレートをカバーしています。 bを使用する針のラント終わり、その穴の外胚を掘る。彼らは、TSSでフロートしますが、水没のままになります。 胚は、前方端に茶色のキャップ、明確な中間領域、及び後端に暗い、灰色の領域（図2、5A）で、明らかに階層表示されます。明確な階層化表示に失敗胚を破棄する。 P200ピペッターを使用して、新しい容器にTSSでも多層胚を転送、アプリケーションに応じて、シンチレーションバイアルやマイクロチューブを例えば。 6）さらなる処理アプリケーションによっては、胚は、その後、様々な方法で扱われます。 明視野または落射蛍光顕微鏡による直接観察のために、胚をガラススライドにバッファに転送され、第1カバーガラススペーサーとして18 × 18 mmの、22×22ミリメートル＃1.5カバースリップの下にマウント。長期的な観測の場合、それは、ハロカーボンオイル27とバッファを交換する必要があります。 胚を固定する場合は、それらのシンチレーションバイアルにステップ5.6で転送する必要があります。次に、これらを標準的な固定手法1を用いて固定することができます。これらの技術は、通常、卵黄膜を除去するためにヘプタン-メタノールのエマルジョンに攪拌を採用しています。遠心分離胚のためにこのdevitellinizationのステップの効率が低いことに注意してください。それは実用的な限り多くの胚を開始するか、手動で1卵黄膜を除去することが望ましいです。 胚が（例えば、遠心分離胚から特定 ​​の細胞小器官の層を除去するために）移植実験で使用される場合は、寒天プレートに転送され、uncentrifuged胚3のような標準的な手順を使用して、カバースリップ上にマウント。遠心分離により誘導されたレイヤーは、数十分のために安定しています。 7）代表結果遠心分離が期待どおりに機能する場合、主要な胚細胞小器官は、高密度の2によってソートします。例えば、低密度の脂肪滴は、前端に蓄積される、高密度卵黄小胞は、後端（図1、2）で蓄積されます。脂質滴と卵黄小胞は、脂質およびタンパク質の貯蔵オルガネラである。 密度に依存した成層の確認は、解剖や化合物を顕微鏡下で透視によって生きている胚の目視検査によって達成される。胚は、図5Aのようになります：脂肪滴は非常に前方のティップ（"脂質キャップ"）で固体茶色の層を形成することになる、卵黄の蓄積が後方端に濃いグレーゾーンになります。これら二つの濃い層が他の細胞小器官と細胞質を表す広範なクリアゾーンで区切られています。胚細胞化後に遠心分離している場合は、レイヤーが（図5C）は最小限になります。 落射蛍光顕微鏡が利用できる場合、これらの生活、遠心分離胚は、UV励起下で調べることができます。これらの条件下では、卵黄が濃いブルーの自家蛍光（図5B）が表示されます。後極での自家蛍光物質のコンパクトな層が成功した遠心分離を示し、後端のためのマーカーとして機能します。 胚が固定されている場合は、これらの層の外観が大幅に変更されることに注意してください。例えば、胚は標準熱またはホルムアルデヒド固定で固定した場合のヘプタン-メタノールdevitellinization 1が続く、脂肪滴は、半透明になり、脂質層はむしろダークブラウン（図5D）よりも、明るい光顕微鏡による白っぽいとフワフワ表示されます。卵黄自家蛍光は、部分的または完全にはるかに少ない強烈な、あるいは検出不可能になった、固定によって破棄されます。 生体内で遠心分離は、1つの特定の細胞小器官を強調するために採用されている場合は、確認のために蛍光マーカーをその細胞小器官を標識するために便利です。例えば、ミトコンドリアを標的とYFPの融合タンパク質は、小胞体やゴルジ体は、4を記載されている。遠心分離した胚では、これらのマーカーは、前方後方軸（図1）に沿って特徴的な位置に蓄積する。最後に、特定のヒストン融合タンパク質が脂肪滴と核2に両方ローカライズするため、（ラベル原子核の数による）これらの細胞区画をマークする（図5 E、F）と同様に胚の段階を監視するために使用することができます。 。この段落に記載されているマーカーを発現するハエの系統は、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター（http://flystocks.bio.indiana.edu/）から入手できます。ヒストンH2Avの場合は、GFPとMRFP変種の両方が5,6用意されています 図1の遠心分離により細胞内小器官（2後に変更された）の分離。明確な層化の指向胚の結果の遠心分離（明るい光）。 、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア（に記載されてYFPマーカーを経由して生きている胚で検出された脂質滴（ナイルレッド染色により固定胚で検出）：後方（下）軸 – 主要な細胞内小器官は、前（上）に沿って特徴的な位置に蓄積するメインテキスト）、卵黄（自家蛍光により検出される）。蛍光画像は、共焦点顕微鏡に買収された。 図2胚の概略図。 A.卵殻及び著名な卵のフィラメント（背アペンデージ）と卵。卵の殻は半透明ではないので、卵は一様に暗く表示されます。 絨毛膜とB.卵は削除されます。前端（左）で、卵門が見えるようになります。開発段階に応じて、卵黄膜内の胚は一様に暗褐色を表示されるか、様々な構造が表示されます。例については図4を参照してください。 C.は、ここに記述されたプロトコルのように指向、胚を遠心分離。脂肪滴は卵門末尾の茶色の"キャップ"として蓄積する、卵黄は反対側の端部またはその近くで灰色の層を形成する。 図3の手順の概略説明。左：絨毛膜のない胚を寒天プレートの上に置かれ、寒天の穴に針でプッシュされます。これは前に、すべての胚の一貫した姿勢で結果を取り付け終わります。右：遠心分離後、胚が階層化されています。寒天は、TSS（青）でオーバーレイされ、そして胚を針で寒天から回収されています。一度TSSに懸濁して、胚をピペットでピックアップすることができます。 彼らは、ステップ4.1で表示される方法に似て住むショウジョウバエの胚の図4。ブライトライトのイメージ、。上下右、背側に左に、後端に前端を、そして腹側：胚は標準配向で表示されます。初期胚発生の時間経過の映画は、このプロトコルを伴う映像の一部として利用可能です。 A.開裂の段階の胚は、一様に茶色に表示されます。このようなステージは、in vivoで遠心分離に最適です。 B.の胚盤葉の胚は、すべての面で同じように表示され、明確な縁を持っている。この明確な周辺部では、形質膜における核の蓄積による部分と卵黄小胞と脂肪滴7の内向きの輸送に起因する部分になります。この明確な周辺部では、細胞化1の終わり近くにまで拡大する。胚はまだ卵黄と原子核のレイヤーは、開裂の段階でのように一貫性がないですが、細胞化8の終わりまで、遠心分離によって正常に層別化することができます。 C.は細胞化した後、胚は非対称表示されますが、背側と腹側の側面が異なるになり、そして様々な折り目が開発しています。示すように、胚は、初期の胚帯の拡張になります。これらの段階では、遠心分離は主要な細胞内小器官を層化ではもはや効果的ではありません。 図5。遠心分離胚。この図中のすべての胚はその前端で、最大遠心分離し、その方向に表示されます。 成功した遠心分離胚のA.は、明るい光の画像。非常に前方端に茶色の層は脂質滴の蓄積によるものです。後端近くに広い灰色の層は、卵黄の小胞によるものです。未知の起源の卵黄膜下クリアゾーンは、頻繁にあります。黄色ゾーンは、卵黄の層の上にしばしば明らかであり、おそらくミトコンドリア表します。可溶性タンパク質が脂肪滴と卵黄2の間の明確な層で発見されています。 B. UV励起下の落射蛍光顕微鏡で見るの胚。卵黄の青色の自家蛍光特性は、後端を識別するのに役立ちます。 C.胚は、細胞化後の胚帯拡張、すなわち、中に遠心分離。卵黄はまだ後方端に蓄積する可能性があるが、それ以外は階層化は最小限に抑えられます。 熱固定後のD.成功成層胚、。脂質滴の層は、むしろ不定胚のようなダークブラウン（）ではなく、白とフワフワ表示されます。 E.＆F.胚His2Av – GFPを発現し、共焦点顕微鏡（2以降に変更された）によって撮像される。 E：開裂の段階で遠心分離し、His2Av – GFPは、いくつかの核がこの時点で形成されているためだけ脂質滴層をマークするために表示されます。焦点面に応じて、核が（ここに示されていない）だけで液滴の層の下に表示されることがあります。 F：胚盤葉の段階で遠心分離し、His2Av – GFPは、脂質滴の層（上部）と核（飛沫層下の広いゾーン内）の両方にマークを付けます。