In vivo d'embryons de drosophile Centrifugation

1) Préparation des plaques d'agar Aperçu: Ce protocole utilise des plaques d'agar pour deux utilisations distinctes. Tout d'abord, les plaques d'agar servir de surface de collecte des œufs; jus de pomme dans la gélose stimule la ponte. Deuxièmement, les embryons intégrés dans la gélose sont détenus dans une orientation fixe lorsque les plaques sont centrifugées; une concentration suffisamment élevée de l'agar est nécessaire pour empêcher les plaques de se désintégrer pendant la centrifugation. Par souci de simplicité, un seul type de gélose au jus de pomme est utilisé pour les deux utilisations. Matériaux Agar (25 g) Saccharose (25 g) Jus de pomme (250 ml) Nipagin M solution mère (5 g méthyl-p-hydroxy-benzoate de méthyle dans 50 ml d'éthanol), agit comme un conservateur Des boîtes de Petri: pour la centrifugation (60x15mm) et pour la collecte des œufs (60×15 mm ou 100×15 mm, selon les cages volantes utilisées dans l'étape 2) Équipement Plaque de cuisson Deux erlenmeyers Dans un erlenmeyer, mélanger 25 g de gélose et 750 ml dH 2 O. Autoclave pendant 50 min sur le cycle de liquide. Dans le même temps, préparer la solution de jus de pomme (étape 1.2). Dans un autre erlenmeyer, mélanger 25 g de saccharose et 250 ml de jus de pomme. Chauffer sur une plaque chaude (à environ 55 ° C) pour dissoudre le saccharose. Ensuite, ajoutez 15 ml Nipagin M solution. Eviter des températures plus élevées, car ils seront la cause Nipagin à se décomposer. Une fois la solution d'agar a suffisamment refroidi que le flacon peut être manipulé à la main, de combiner les deux solutions et bien mélanger. Incorporer sur plaque chauffante jusqu'à homogénéité. Verser la solution dans des boîtes de Pétri (~ 0,5 cm de haut). 1 litre de solution est suffisant pour environ 100 petits (60 mm de diamètre) ou 40 grands (100 mm de diamètre) plats. Plaques de gélose doit sécher pendant plusieurs heures ou une nuit à température ambiante, sinon ils seront trop humide pour l'utiliser. Pour stockage à long terme, les garder enveloppé (dans des bacs en plastique ou en boîte de Pétri manches) à 4 ° C. La récolte des embryons 2) Présentation: Pendant les 3 premières heures de développement (à température ambiante), les embryons de drosophile sont des cellules simples (sans compter les précurseurs des cellules germinales, les cellules pôle postérieur situé). Lorsque des embryons correctement orientée de ces étapes sont centrifugés, les organites majeurs séparés par la densité long du grand axe de l'œuf. Au stade cellularisation, cette grande cellule unique est converti en des milliers de petites cellules; les forces de centrifugation employé ne sera pas la rupture de ces cellules. Pour la séparation réussie des organites majeurs, il est donc essentiel de centrifugeuse embryons qui n'ont pas encore terminé cellularisation. Matériaux Plaques d'agar jus de pomme Pâte de levure (levure sèche mélangée à l'eau au beurre d'arachide de cohérence) Équipement Fly cages: disponible dans le commerce (voir ci-dessous) ou une maison Mouches adultes sont gardés dans des cages dont les plaques d'agar de pomme jus sont apposées au bas. Utiliser une taille de boîtes de Petri approprié pour les cages en usage. Pour lancer une collecte d'œufs, de préparer une plaque de gélose à la pomme fraîche et le jus de couvrir une partie de la levure à la pâte. Les mouches à fruits mange de la levure, en particulier, la levure fournit la nutrition pour la production d'oeufs. La présence de levures et de jus de pomme dans la gélose induit également la ponte. Pour échanger les anciens avec les nouvelles plaques de gélose, la cage mouche est inversé et cogné sur la paillasse à quelques reprises. Les mouches vont tomber au fond et sont brièvement désorienté. Cela vous donne quelques secondes pour enlever rapidement une plaque de gélose et le remplacer par une neuve. Cet échange prend une certaine pratique, et les détails dépendent du type de cage utilisé. Femme mouches magasin à partir du sperme d'accouplements précédents dans des sachets internes (spermathèques) à partir de laquelle le sperme est libéré pour permettre la fécondation des œufs. Quand bien nourris et non perturbées, les femelles pondent des oeufs peu après la fécondation, et donc le moment de la ponte marque le moment de la fécondation et le début du développement. Lorsque les conditions ne sont pas optimales, les femelles maintenir les œufs fécondés pendant des temps variables avant la pose. Afin de minimiser le nombre de ces mal mis en scène des embryons, il est conseillé de jeter la première collection de la journée de travail (un «pré-collecte» de 30 à 60 minutes suffisent). La présence de la levure fraîche induit l'femelles pondent ces oeufs détenus, et les collections d'œufs ultérieurs tendent à être dominés par les oeufs déposés peu après la fécondation. Collecter les œufs pendant 3 heures, selon le stade embryonnaire est souhaitée. Depuis au cellularisation température ambiante est terminée après environ 3,5 heures, temps de collecte ne sont pas plus utiles. La plupart des couches cohérent est réalisé dans le jeune embryon, donc pour des expériences de routine nous privilégions les temps de collecte plus court (1 hou moins). Parfois, des mouches se coincer à la levure ou à la surface de la plaque de gélose. Retirez-les avec des pincettes. 3) Enlever la coquille d'oeuf sur les embryons Vue d'ensemble: des embryons de drosophile sont couverts par deux couches de protection: une couche externe (chorion) constitués de protéines et une couche intérieure (vitelline membrane) essentiellement faite de cire. Ils protègent l'embryon contre les insultes mécanique et la dessiccation. Le chorion possède deux extensions (les filaments d'oeuf ou appendices dorsaux) qui sont facilement visibles en tant que structures distinctes. Dans cette étape, nous allons supprimer le chorion en trempant les œufs dans l'eau de Javel à 50%. Une fois que le chorion est retiré, l'embryon devient transparent à la lumière transmise, permettant la sélection de certaines étapes embryonnaires pour la centrifugation. Comme le chorion serait également interférer avec de nombreux post-centrifugation procédures (par exemple, la fixation à l'étape 6), la suppression du chorion aujourd'hui permettra un traitement rapide plus tard. Le traitement eau de Javel à 50% va dissoudre le chorion en quelques minutes, mais elle ne nuit pas à l'embryon. La membrane vitelline conserve le hors eau de Javel. Nous allons continuer le traitement jusqu'à ce que l'eau de Javel filaments d'œufs ne sont plus visibles. Ensuite, nous allons séparer les embryons de l'eau de Javel en versant le coulis embryon / eau de javel à travers un tamis minuscules (un panier en treillis métallique). Il est essentiel de ne pas précipiter l'étape d'exposition javel. Si l'eau de Javel est lavé prématurément, les étapes ultérieures (par exemple, la suppression de la fixation vitelline membrane suite) pourrait être compromise. Matériaux: Une bouteille d'eau de Javel à 50% (un volume dH 2 O à une eau de Javel volume commercial) Une bouteille avec dH 2 O Serviette en papier Equipement: Paniers en fil fait maison faite de feuilles de treillis métallique en acier inoxydable. Pour faire des paniers, couper des carrés de ~ 2 x 2 cm sur la feuille à plat et les mettre en retrait au milieu. Brucelles à tenir paniers en fil Microscope à dissection mis en place pour la transillumination Placer la plaque de gélose sous un microscope à dissection et d'observer les embryons par transillumination. Assurez-vous d'identifier les filaments d'oeuf (voir figure 2A). Squirt javel à 50% sur la plaque de gélose, couvrant les embryons. Agiter la plaque de gélose occasionnellement à tourbillonner autour de l'embryon dans l'eau de Javel. Une fois les filaments d'œufs ne sont plus visibles (typiquement après 3-5 minutes, mais les horaires peuvent varier), le chorion a été supprimé avec succès. Dans la prochaine étape, un panier en treillis métallique sera utilisé comme tamis pour séparer les embryons de l'eau de Javel. Prenez le panier métallique avec des pincettes et maintenez sur la couverture inversée de la plaque de gélose. La couverture servira de réservoir pour attraper les gouttes eau de javel à travers le grillage. Verser la boue de javel / embryon à partir de la plaque de gélose à travers le grillage. Si un nombre important d'embryons restent sur ​​la plaque de gélose, squirt dH 2 O sur la plaque et versez le coulis dH 2 O / embryon à travers le grillage. Si un nombre important d'embryons déborder dans le réservoir, versez le contenu du réservoir à travers le grillage. Toucher le fond du treillis métallique pour une serviette en papier pour éponger l'écart de tout liquide en excès. Ensuite gicler dH 2 O sur le grillage pour se rincer l'eau de Javel restant. Comme décrit ci-dessus, le couvercle peut être utilisé comme réservoir pour récupérer les embryons accidentellement lavé. Vous pouvez minimiser la perte des embryons en pointant le flux d'eau de la bouteille d'injection le long du périmètre du panier de fil. Foire blot excès de liquide. Répétez cette étape de lavage cinq à dix fois, jusqu'à ce que tous Javel a été supprimée. Si le panier métallique sent encore d'eau de Javel, le lavage doit se poursuivre. Embryons 4) Montage en gélose Vue d'ensemble: les oeufs de drosophile sont beaucoup plus longs (~ 500 um) que large (~ 180 um). Pour obtenir une séparation maximale et uniforme des organites pendant la centrifugation, nous embryons d'orienter de telle sorte que leur point antérieure extrémités vers le centre de rotation (Figure 1, 3). De cette façon, le plus léger des structures intracellulaires (gouttelettes lipidiques) s'accumulent à l'extrémité antérieure dans tous les embryons, tandis que des structures très denses (composants jaune) s'accumuler près de l'extrémité postérieure. Les embryons sont insérés dans les petits trous verticaux dans l'agar jus de pomme, avec les extrémités antérieures en l'air. L'agar maintient l'embryon dans une orientation fixe pendant la centrifugation. Equipement: Porte-aiguille Aiguilles de tungstène, les aiguilles sont montées dans le support arrière de l'orientation typique, de sorte que l'extrémité émoussée bâtons sortir et est disponible pour manipuler les embryons P200 pipeteur Microscope à dissection mis en place pour transillumination Fly pinceau (petit pinceau utilisé pour trier les adultes drosophile) Matériaux: Triton solution de sel (TSS): 4g NaCl, 0,3 ml de Triton X-100, remplir avec de ddH 2 O à 1000 ml (peut être fait comme une solution stock de 10x) Lavez les embryons de la corbeille fil avec TSS et dans un plat vide de Pétri. Les embryons doivent couler au fond. Transférer la boîte de Pétri contenant les embryons dans TSS sur un champ de dissection et d'observer par transillumination (embryons seront similaires à ceux représentés dans la figure 4). Aide d'une pipette P200, sélectionner les embryons des stades souhaités et de les transférer sur une plaque de gélose de petite taille. Les étapes spécifiques peuvent être facilement reconnus visuellement (figure 4; pour plus de détails, voir 1). Travaillez rapidement car les embryons sont le vieillissement et immersion prolongée (plus de 30 min) dans TSS peut affecter le développement. Enlever la plupart des TSS avec une pipette et un Kimwipe. La surface de la gélose doit être légèrement humide ce qui rend plus facile à pousser embryons autour. Cependant, il ne doit pas être piscines de liquide restant n'importe où sur le plateau, depuis l'excès de liquide pendant la centrifugation provoque les embryons de glisser hors des trous. En utilisant une aiguille, percez des trous verticaux dans la gélose à proximité de là où un embryon est situé. Il est difficile de faire des trous qui sont parfaitement à la verticale, car vous devez tenir l'aiguille à un angle pour être capable de regarder simultanément sous le microscope. Une inclinaison de l'aiguille mineures est réellement avantageux, car cela crée une légère dépression / bocage sur un côté du trou de sorte que l'embryon se glisser facilement le long de lui et dans le trou. Il suffit de percer la surface de l'agar agar depuis l'est assez mou qu'une fois que l'embryon est partiellement insérée dans un trou, il peut être poussé au plus loin sans dommage. Assurez-vous reconnaître les extrémités antérieure et postérieure de l'embryon, que les embryons doivent être poussés dans les trous dans une orientation cohérente, généralement avec l'extrémité antérieure jusqu'à. La membrane vitelline à l'extrémité antérieure se caractérise par une structure spécialisée, le micropyle (figure 2), à travers lequel le sperme pénètre lors de la fécondation. Utilisation de l'extrémité émoussée de l'aiguille, vous pouvez pousser contre l'embryon pour le déplacer le long de la gélose et d'orienter / manoeuvre son extrémité postérieure vers un trou percé. Puis pousser contre l'extrémité antérieure vers le trou. Cela devrait facilement glisser l'embryon dans le trou le long de la légère dépression générée pendant la perforation. Comme l'embryon s'incline, le pousser plus profondément dans le trou. Une fois complètement enfoncé, l'embryon est généralement déjà assez verticale. Sinon, vous pouvez aligner l'embryon inséré plus verticalement en poussant dessus latéralement. Si le trou n'est pas trop grand, la position embryon sera stablement détenus par l'agar travers centrifugation. Avec la pratique, il est possible d'embarquer de 100 à 250 embryons par plaque. Il dépendra de l'application particulière combien sont nécessaires: Si les embryons sont utilisés pour l'imagerie en direct ou en tant que donneurs d'expériences de transplantation, peu sont nécessaires. Si les embryons doivent être fixes et immunocolorés, une fraction sera perdue durant le traitement post-centrifugation, et on doit commencer avec un nombre plus élevé. Gardez à l'esprit que les embryons continuent à se développer pendant le montage, donc si un stade de développement étroite est souhaitée, le temps global pour les besoins de montage pour être courtes. S'il ya des restes d'embryons qui n'ont pas été intégrés, les retirer de la plaque avec une brosse humide volée. Trempez la brosse volent en liquide (par exemple 1xTSS), essuyez soigneusement à travers le dessus de la plaque (en regardant sous le microscope à dissection) pour balayer toute embryons excédentaires, et laver les embryons hors de la brosse en trempant le pinceau dans le liquide de nouveau. 5) La centrifugation et la récupération des embryons Vue d'ensemble: Les plaques sont transférées à balancer des seaux d'un Sorvall RT7 plus centrifugeuse et centrifugé pendant 30 min à 4000 rpm, ce qui correspond à ~ 3000 g. Après centrifugation, les plaques sont couvertes de TSS. Avec une aiguille, les embryons sont creusés des trous dans la gélose et transférées dans des récipients appropriés par l'intermédiaire d'une pipette. Equipement: Porte-aiguille avec une aiguille (comme avant) Sorvall RT7 Plus avec RTH750 rotor et seaux à bascule ou deux équivalents Microscope à dissection mis en place pour la transillumination P200 pipeteur Matériaux: TSS Transfert des plaques d'seaux balancer du côté de gélose centrifugeuse, en baisse. Assurez-vous centrifugeuse est équilibrée. Réglages pour la centrifugation: température = 4-10 ° C, min = 4000, temps = 30 min. Après la centrifugation, la plaque de gélose place sous le microscope de dissection à nouveau et recouvrir la plaque avec une couche de TSS. Utiliser le bLunt fin de l'aiguille, creuser les embryons sortis de leurs trous. Ils flottent dans le TSS, mais restera submergé. Embryons apparaîtra évidemment en couches, avec une casquette brune à l'extrémité antérieure, une région médiane claire, et un noir, la zone grise à l'extrémité postérieure (figure 2, 5A). Jeter les embryons qui ne se présentent en couches distinctes. Aide d'une pipette P200, le transfert des embryons bien-couches dans les MES à un nouveau navire, par exemple, un flacon à scintillation ou microtube, selon l'application. 6) Le traitement ultérieur Selon l'application, les embryons seront ensuite traitées de diverses façons. Pour l'observation directe par microscopie champ lumineux ou épifluorescence, les embryons sont transférés dans la mémoire tampon pour une lame de verre et monté sous un 22×22 mm # 1.5 lamelle, avec mm 18×18 # 1 des lamelles d'entretoises. Pour observations à long terme, il peut être nécessaire de remplacer le tampon avec 27 d'huile d'halocarbures. Si les embryons doivent être fixés, ils devraient être transférés à l'étape 5.6 dans une fiole à scintillation. Ils peuvent alors être fixés en utilisant des techniques de fixation standard 1. Ces techniques utilisent généralement l'agitation dans une émulsion de méthanol-heptane pour enlever la membrane vitelline. Notez que pour les embryons centrifugé l'efficacité de cette étape devitellinization est faible. Il est donc conseillé de commencer avec des embryons autant que pratique ou d'enlever la membrane vitelline manuellement 1. Si les embryons seront utilisés dans des expériences de transplantation (par exemple, d'enlever une couche particulière de la organite embryons centrifugé), ils sont transférés à des plaques d'agar et montés sur des lamelles, en utilisant des procédures standard pour les embryons non centrifugé 3. La stratification induite par centrifugation est stable pendant plusieurs dizaines de minutes. 7) Les résultats représentatifs Si la centrifugation a fonctionné comme prévu, les organites majeurs embryonnaires tri par densité 2. Par exemple, les gouttelettes lipidiques à faible densité vont s'accumuler à l'extrémité antérieure; les vésicules haute densité jaune vont s'accumuler à l'extrémité postérieure (Figure 1, 2). Gouttelettes lipidiques et vésicules jaunes sont des organites de stockage pour les lipides et les protéines. Confirmation de densité-dépendante de stratification est réalisée par l'inspection visuelle des embryons vivants par transillumination sous un microscope à dissection ou composé. Les embryons doivent apparaître comme la figure 5A: Les gouttelettes lipidiques va former une couche solide brun à l'extrémité antérieure (un «plafond de lipides»); l'accumulation jaune se traduira par une zone gris foncé à l'extrémité postérieure. Ces deux couches sombres sont séparés par une large zone claire qui représente d'autres organites et le cytoplasme. Si les embryons sont centrifugés après cellularisation, marcottage sera minime (figure 5C). Si un microscope à épifluorescence est disponible, ces vivants, d'embryons centrifugé peut être examiné sous excitation UV. Dans ces conditions, le jaune d'affiche intenses autofluorescence bleue (figure 5B). Une couche compacte de matériau autofluorescente au pôle postérieur indique centrifugation succès et sert de marqueur pour l'extrémité postérieure. Notez que l'apparence de ces couches vont changer radicalement si les embryons sont fixes. Par exemple, lorsque les embryons sont fixés par une fixation à la chaleur ou du formaldéhyde standard suivie d'heptane-méthanol devitellinization 1, gouttelettes lipidiques deviennent translucides et la couche lipidique est blanchâtre et mousseuse par microscopie à la lumière vive, plutôt que brun foncé (figure 5D). Yolk autofluorescence est partiellement ou complètement détruits par la fixation, devient beaucoup moins intense, voire indétectable. Si in-vivo de centrifugation est utilisée pour souligner un organite particulier, il est utile d'étiquette qui organite avec un marqueur fluorescent pour confirmation. Par exemple, les protéines de fusion YFP ciblé à la mitochondrie, l'ER ou l'appareil de Golgi ont été décrits 4. Dans les embryons centrifugé, ces marqueurs s'accumulent à positions caractéristiques long de l'axe antéro-postérieure (Figure 1). Enfin, certaines protéines de fusion histone localiser à la fois pour gouttelettes lipidiques et 2 noyaux, et peuvent donc être utilisés pour marquer ces compartiments cellulaires (figure 5 E, F), ainsi que pour surveiller le stade de l'embryon (par le nombre de noyaux marqués) . Fly souches exprimant les marqueurs mentionnés dans ce paragraphe sont disponibles à partir du centre de Bloomington drosophile stock (http://flystocks.bio.indiana.edu/). Pour H2Av histones, les deux variantes de GFP et RDRF sont disponibles 5, 6 Figure 1. Séparation des organites par centrifugation (modifié d'après 2). La centrifugation des résultats embryons orienté dans la stratification distincte(Lumière). Organites majeurs s'accumulent au long de la caractéristique de positions antérieures (jusqu'à) – postérieur (vers le bas) axes: gouttelettes lipidiques (détecté dans les embryons fixés par le Nil Rouge coloration); réticulum endoplasmique, Golgi, et les mitochondries (détecté dans les embryons vivants via les marqueurs décrits dans YFP le texte principal); jaune (détecté par autofluorescence). Les images de fluorescence ont été acquises par microscopie confocale. Figure 2. Représentation schématique des embryons. A. oeuf avec coquille d'oeuf et les filaments d'oeuf éminents (appendices dorsaux). Comme la coquille d'oeuf n'est pas translucide, l'oeuf apparaît uniformément sombre. B. oeufs avec chorion enlevé. A l'extrémité antérieure (à gauche), le micropyle est visible. Selon le stade de développement, l'embryon à l'intérieur de la membrane vitelline apparaîtra uniformément brun foncé ou de montrer les différentes structures. Voir Figure 4 pour des exemples. C. centrifugés embryon, orientée comme dans le protocole décrit ici. Gouttelettes de lipides s'accumulent comme une brune "bouchon" à la fin micropyle; jaune forme une couche grise à ou près de l'extrémité opposée. Figure 3. Description schématique de la procédure. Gauche: embryons sans chorion sont placés sur le dessus d'une plaque d'agar et poussé avec une aiguille dans les trous dans la gélose. Ce montage se traduit par une orientation cohérente de tous les embryons, avec antérieure finit. Droite: Après centrifugation, les embryons sont stratifiées. Agar est recouvert par TSS (bleu), et les embryons sont récupérés à partir de la gélose avec l'aiguille. Une fois en suspension dans le TSS, les embryons peuvent être ramassés avec une pipette. Figure 4. Lumière vive des images d'embryons de drosophile vie, semblable à la façon dont ils apparaissent à l'étape 4.1. Les embryons sont indiquées dans l'orientation standard: extrémité antérieure à gauche, extrémité postérieure à la droite, jusqu'à la face dorsale et face ventrale vers le bas. Un film accéléré de l'embryogenèse précoce est disponible en tant que partie de la vidéo qui accompagne ce protocole. A. embryons étape de clivage apparaissent uniformément brun. Étapes de ce genre sont idéales pour in-vivo centrifugation. Embryons de blastoderme B. ont une jante clair que semble similaire sur tous les côtés. Cette périphérie clair, c'est en partie dû à l'accumulation de noyaux à la membrane plasmique et en partie en raison du transport vers l'intérieur des vésicules et des gouttelettes lipidiques jaune 7. Cette périphérie clairs s'étend jusqu'à proximité de la fin de cellularisation 1. Les embryons peuvent encore être stratifiée avec succès par centrifugation jusqu'à la fin de cellularisation 8, bien que la superposition de jaune et de noyaux n'est pas aussi cohérente que dans les stades de clivage. C. Après cellularisation, apparaissent des embryons asymétrique; côtés dorsales et ventrales sont distincts, et différents plis se développer. L'embryon est montré au début de germe de bande d'extension. Dans ces étapes, la centrifugation n'est plus efficace à stratifier les organelles majeurs. Figure 5. Embryons centrifugé. Tous les embryons dans cette figure ont été centrifugés à leur extrémité antérieure et sont présentés dans cette orientation. A. lumière vive image d'un embryon de succès centrifugé. Une couche brune à la fin antérieure est dû à l'accumulation de gouttelettes lipidiques. Une large couche grise près de l'extrémité postérieure est due à des vésicules jaunes. Il ya souvent une zone claire en dessous de la couche de jaune, d'origine inconnue. Une zone jaunâtre est souvent apparente dessus de la couche jaune, il représente sans doute les mitochondries. Les protéines solubles sont trouvés à travers la couche claire entre gouttelettes lipidiques et le jaune 2. B. L'embryon dans une vue en microscopie à épifluorescence sous excitation UV. L'autofluorescence bleue caractéristique du jaune permet d'identifier l'extrémité postérieure. Embryon C. centrifugé pendant germes bande d'extension, c'est à dire, après cellularisation. Jaune peut encore s'accumuler à l'extrémité postérieure, mais autrement, la stratification est minime. Réussir l'embryon D. stratifié, après la fixation de la chaleur. La couche lipidique goutte apparaît en blanc et duveteux, plutôt que brun foncé que chez les embryons non fixée (A). Embryons E. & F. exprimer His2Av-GFP et imagée par microscopie confocale (modifié d'après 2). E: centrifugé à des stades de clivage; His2Av-GFP ne semble marquer la couche lipidique-goutte depuis quelques noyaux sont formés par cette époque. Selon le plan focal, les noyaux peuvent être visibles juste sous la couche de gouttelettes (non représenté ici). F: centrifugé à des stades de blastoderme; His2Av-GFP marque à la fois la couche lipidique-gouttelettes (en haut) et des noyaux (dans une large zone en dessous de la couche de gouttelettes).