果蝇胚胎的体内离心

1）准备琼脂平板 概述：此协议采用琼脂平板上，两个不同的用途。首先，琼脂平板作为鸡蛋征收面;苹果汁琼脂刺激产蛋。其次，在琼脂嵌入式胚胎举行，在一个固定的方向时板离心;一个足够高的浓度，琼脂是必要的，以防止在离心瓦解板。为了简便起见，都使用单一类型的苹果汁琼脂聘用。 材料琼脂（25克） 蔗糖（25克） 苹果汁（250毫升） 尼泊金中号原液（5克甲基- P -羟基苯甲酸在50 mL无水乙醇），作为防腐剂培养皿：离心（60x15mm）和鸡蛋收集（60×15毫米或100×15毫米，根据在第2步使用的飞笼） 设备热板两个锥形瓶在锥形瓶中，结合25克琼脂和750毫升DH 2 O。高压灭菌液体周期为50分钟。与此同时，准备苹果汁溶液（步骤1.2）。 在另一锥形瓶中，结合25克蔗糖和250毫升的苹果汁。热板的热（约55℃）溶解蔗糖。然后添加15毫升尼泊金中号溶液。避免较高的温度，因为它们会导致尼泊金打破。 一旦琼脂溶液冷却烧瓶中可以通过手工处理，将二者结合起来的解决方案，调匀。热板搅拌，直到混合均匀。 倒入培养皿（约0.5厘米高）的解决方案。 1公升的解决方案就足够了大约100个​​小型（直径60毫米）或40大直径（100毫米）菜肴。 琼脂平板应干几个小时或在室温下过夜，否则会太湿的使用。对于长期贮存，保持他们包裹在塑料箱或培养皿袖子在4 ° C。 2）收获胚胎 概述：在发展的第3小时（室温）， 果蝇胚胎的单个细胞（不计的种系的前体，向后位于杆细胞）。当这些阶段的正确导向胚胎离心，密度单独的主要细胞器沿长轴鸡蛋。 cellularization阶段，这个大的单细胞转换成数以千计的小细胞，离心势力不会破裂，这些细胞。主要细胞器的成功分离，因此，它是关键离心机尚未完成cellularization的胚胎。 材料苹果汁琼脂平板酵母膏（花生酱的一致性，与水混合干酵母） 设备蝇笼：市售（见下文）或自制的1 成人苍蝇都保存在苹果汁琼脂平板贴在底部的笼子。使用培养皿中使用的笼子适当的大小。 要启动一个鸡蛋收集，准备一个新鲜的苹果汁琼脂平板，并涵盖了部分与酵母膏。果蝇吃酵母，尤其是酵母提供营养蛋的生产。酵母和苹果汁琼脂的存在也引起产蛋。 交换旧与新的琼脂平板，飞笼倒在板凳上的顶部撞了几次。苍蝇将下降到谷底，并简要地迷失方向。这就给了你几秒钟，迅速取出一个琼脂平板，并更换新鲜。这种交流需要一些练习，和细节上笼的类型取决于。 从以前的交配内部邮袋（精囊）发布的精子使卵受精的雌性果蝇储存精子。当美联储和不受干扰，雌虫受精后不久，蛋，产蛋的时间，从而标志着受精和发展开始的时间。当条件不理想，女性持有铺设前的受精卵变量倍。为了尽量减少这样的MIS上演胚胎的数量，最好是放弃第一个工作日的集合（“预收款”的30至60分钟就足够了）。鲜酵母的存在导致女性打下这些举行的蛋，和随后的蛋集合往往是由鸡蛋为主沉积在受精后不久。 鸡蛋收集长达3个小时，这取决于所需的萌芽阶段。由于是在室温下cellularization〜3.5小时后完成，收集时间较长用处都没有。最一致的分层实现了幼胚，常规实验，我们赞成征收时间较短（1小时或更少）。 有时苍蝇卡住酵母或琼脂平板表面。用镊子取出。 3）从胚胎取出蛋壳 概述：外层（绒毛膜）（卵黄膜）为主制成的蛋白质和内层蜡： 果蝇胚胎是由两个保护层覆盖。他们免受机械侮辱和干燥的胚胎。绒毛膜有两个扩展（鸡蛋丝或背附属物）作为独特的结构，很容易可见。在这一步，我们将删除50％的漂白粉浸泡鸡蛋的蛋壳。胚胎绒毛膜一旦被删除，变得透明，在透射光下，允许选择具体的萌芽阶段，离心。由于绒毛膜也会干扰许多离心后的程序（例如，固定在第6步），去除绒毛膜现在将允许快速处理后。 50％的漂白治疗绒毛膜会溶解在几分钟之内，但它不会伤害胚胎。卵黄膜保持漂白了。我们将继续漂白处理，直到鸡蛋丝不再可见。之后，我们将单独浇通过一个很小的筛子（丝网制成的一篮子）的胚胎/漂白浆漂白的胚胎。至关重要的是不要急于漂白的曝光步骤。如果漂白洗掉过早，以后的步骤（例如，去除卵黄膜下面固定）可能会受到损害。 材料： 50％漂白水喷瓶（一个卷一个卷商业漂白DH 2 O ） 水枪瓶与DH 2 O 纸巾设备： 国产钢丝篮，不锈钢丝网张。为了使篮，切〜2 × 2厘米的平板平方和缩进在他们中间。 用镊子将举行丝篮解剖显微镜设置为透琼脂平板上，并放置在解剖显微镜下观察胚胎透。确保识别鸡蛋丝（见图2A）。 水枪50％的琼脂平板上，漂白剂，覆盖的胚胎。偶尔搅动琼脂平板胚胎周围的漩涡中的漂白。 一旦鸡蛋丝不再可见（通常在3-5分钟，但时间可能有所不同），绒毛膜已成功删除。 在接下来的步骤，丝网篮将被用来作为筛分开漂白剂的胚胎。用镊子抓住篮筐，缓缴琼脂平板倒盖。封面将作为水库捕获的漂白剂滴通过丝网。 通过琼脂平板丝网倒入浆的漂白/胚胎。 如果大量的胚胎留在琼脂平板上，喷出的dh 2到盘子和倒通过丝网的dh 2 /胚胎浆。如果大量的胚胎溅入水库，通过丝网倒入水库的内容。 丝网底部的触摸纸巾吸干了任何多余的液体。然后喷射到丝网DH 2 O冲洗掉剩余的漂白。如上所述，盖板可以被用来作为水库恢复不小心洗掉任何胚胎。您可以最大限度地减少损失，指向沿着篮筐周围喷瓶水流的胚胎。常见吸干多余的液体。 重复此清洗步骤五到十倍，已被删除，直到所有的漂白剂。如果篮筐仍然气味的漂白剂，洗衣机应该继续下去。 4）在琼脂安装胚胎 概述： 果蝇卵是远远长于宽（〜180微米）（〜500微米）。为了获得最大的和一致的过程中离心分离细胞器，我们东方的胚胎，其前结束对旋转中心的点（图1，3）。通过这种方式，最轻的细胞内的结构脂滴积聚于前年底在所有的胚胎，而非常致密的结构（蛋黄组件）附近的后结束积累。胚胎苹果汁琼脂小垂直孔插入，坚持前结束。琼脂保持在一个固定在离心方向的胚胎。 设备： 持针器钨针，针安装在持有人从典型的方向向后，使钝端伸出操纵胚胎 P200的移液器解剖显微镜设置为transilluminatioñ 飞刷（小油漆刷用来排序成年果蝇） 材料： 海卫盐溶液（TSS）：4G氯化钠，0.3毫升TRITON X – 100，填写至1000毫升（可作为一个10倍的股票解决方案与DDH 2 O ） 洗篮筐的胚胎与TSS和到一个空的培养皿。胚胎沉底。解剖范围转移到TSS中含有胚胎的培养皿，观察和透（胚胎将类似于如图4所示）。 使用P200的移液器，选择所需阶段的胚胎，将它们转移到一个小琼脂平板。特定阶段可以很容易地被认可的视觉（图4;如需详细资讯，请参阅1） 。因为胚胎的老化和长期淹没在TSS（长于30分钟）可能会影响发展迅速。 取出用移液器和Kimwipe最TSS的。琼脂表面应稍湿润，这使得它更容易推胚胎。但是，不应该其余板的任何地方，在离心过程中多余的液体，因为会导致胚胎幻灯片孔液体池。 用针，垂直孔捅到附近的地方位于一个胚胎的琼脂。是完全垂直的万佛洞，这是很难，因为你必须保持在一个角度的针能够同时在显微镜下观看。一个轻微的倾斜针实际上是有利的，因为这将创建洞的一侧有轻微的抑郁症/树丛，使胚胎很容易滑动和成孔。这是足够的琼脂穿刺琼脂表面，因为是软的，足够的，它可以在不损害进一步推到一个孔中插入一个胚胎一次是部分。 确保你认识的胚胎的前部和后部的结束，胚胎应推入孔方向一致，与前年底通常可达。前结束的卵黄膜是由专门的结构特点，珠孔（图2），通过它在受精过程中精子进入。 使用的针头钝端，你可以把对胚胎沿着琼脂和东方/机动走向刺破孔后结束。对孔，然后反推前结束。这应该很容易滑动沿在穿刺产生的轻微的抑郁症孔进入胚胎。由于胚胎倾斜，推动更深的成孔。 全面推开时，胚胎通常已经相当垂直。如果没有，你可以更垂直对齐插入的胚胎由侧向推它。如果孔是不是太大，胚胎的位置将稳定整个离心琼脂举行。 通过实践，它是可以嵌入到每板100-250胚胎。这将取决于特定的应用程序需要多少：如果胚胎用于实时成像或捐助者移植实验中，只有少数需要。如果胚胎加以固定和免疫染色，一小部分将失去在离心后处理，并开始与更高的数字。请记住，胚胎继续发展过​​程中安装这样一个狭窄的发展阶段，如果需要，安装需要的总时间要尽量短。 如果有任何剩余的胚胎，不嵌入，用蘸飞刷从板块中删除。沾飞刷成液体（例如1xTSS），仔细地擦拭板的顶部（下解剖范围看）扫描任何剩余的胚胎，而胚胎的刷子清洗浸泡成液体的刷一遍。 5）离心和胚胎复苏 概述：板转移到摆动水桶一个Sorvall RT7加离心机离心30分钟在4000转，这相当于约3000克。离心后，板与TSS的覆盖。用针，胚胎被挖了出来在琼脂上的孔，并通过移液器转移到适当的船只。 设备： 针持针器（如前） Sorvall RT7加RTH750转子和摆动水桶，或相当于2 解剖显微镜设置为透 P200的移液器材料： TSS 传输板，离心机，琼脂的一面向下摆动水桶。确保离心机的均衡。 离心设置：温度= 4-10 ° C，转速= 4000时间= 30分钟。 经过离心，琼脂平板解剖显微镜下再次和覆盖层的TSS板。 使用B针水汽年底，掏的胚胎，其孔。他们将在TSS的浮动，但仍将淹没。 胚胎会出现明显分层，棕色第一个在年底前，一个明确的中部地区，一片漆黑，在后部的灰色地带（图2，5A）。丢弃的胚胎，未能表现出鲜明的分层的。 使用P200的移液器，TSS到一个新的船只的层次胚胎转移，如闪烁瓶或离心管，根据不同的应用。 6）进一步处理根据不同的应用，胚胎也将随之被视为以不同的方式。 明场或epifluorescence显微镜直接观察，胚胎在缓冲区转移到玻片上，并安装在一个22×22毫米＃1.5盖玻片＃1盖玻片18 × 18毫米间隔。对于长期观察，它可能是必要的，以取代卤烃油27缓冲区。 如果是固定的，胚胎，他们应该在步骤5.6转移到闪烁瓶中。然后，他们可以是固定的，使用标准的固定技术 1 。这些技术通常采用在庚烷甲醇乳化搅拌，去除卵黄膜。注意离心胚胎这一devitellinization步骤的效率是低的。因此，建议开始与实际许多胚胎或手动删除卵黄膜1。 如果胚胎将被使用（例如，删除一个特定的细胞器层）的离心胚胎移植实验，他们转移到平 ​​板装上盖玻片，使用标准程序3 uncentrifuged胚胎。离心诱导分层是稳定的几十分钟。 7）代表性的成果如果离心工作不如预期，主要胚胎细胞器将理清密度2。例如，低密度脂滴积聚于前年底，高密度的蛋黄囊泡会积聚在后结束（图1，2）。脂滴和蛋黄囊泡存储脂类和蛋白质的细胞器。 透密度依赖分层的确认是通过解剖或复式显微镜下，通过目视检查活胚胎。胚胎应该出现在图5A：脂滴将在很前的提示（“脂盖”），形成一个坚实的的棕色层;卵黄积累后的最终结果将在一个黑暗的灰色地带。代表其他细胞器和细胞质了广阔的明确区分开这两个暗层。如果胚胎后cellularization离心，分层将微乎其微（图5C）。 如果epifluorescence显微镜，这些生活，离心胚胎紫外线激发下可以检查。在这些情况下，蛋黄，显示了强烈的蓝色自体荧光（图5B）。一个在后极autofluorescent材料的致密层，表示成功离心后结束的标记。 请注意，这些层的外观将发生急剧变化，如果胚胎是固定的。例如，当胚胎是由固定的标准热或甲醛固定庚烷甲醇devitellinization 1，成为半透明的脂滴和脂质层出现发白和蓬松的，由明亮的光镜，而不是黑褐色（图5D ）。卵黄自体荧光是由固定部分或完全被毁，成为少得多激烈，甚至检测不到。 如果体内离心突出一个特定的细胞器，它是有帮助的标签，细胞器与荧光标记进行确认。例如，YFP的融合蛋白定位到线粒体，ER或高尔基被描述4。在离心胚胎，这些标志物堆积在沿前后轴（图1）的特征位置。最后，某些组蛋白的融合蛋白本地化脂滴和原子核 2，因而可以用来标记这些细胞车厢（图5，E，F）以及监控胚胎阶段（标记细胞核的数量） 。可从布卢明顿果蝇股票中心（http://flystocks.bio.indiana.edu/）飞株表达在本段中提到的标记。对于组蛋白H2Av，GFP和MRFP变种是5， 6 图1通过离心分离细胞器（修改后 2） 。离心型胚胎在不同的分层结果（耀眼的光芒）。主要细胞器的积累特征的立场，沿前（上） – 后（下）轴：脂滴（固定胚胎尼罗红染色检测）;内质网，高尔基体，线粒体（活胚胎通过在YFP的标记检测主要文本）;蛋黄（自体荧光检测）。共聚焦显微镜，荧光图像被收购。 图2原理图描绘的胚胎。 答：鸡蛋与鸡蛋壳和突出的鸡蛋丝（背附肢。）由于鸡蛋壳是不透光的，出现鸡蛋均匀黑暗。 B.与蛋壳的蛋删除。前端（左），珠孔是可见的。根据发展阶段，胚胎内的卵黄膜会出现均匀暗棕色或显示不同的结构。参见图4-3的例子。 C.离心胚胎，在这里描述的协议为导向。脂滴的积累作为一个棕色的“帽子”，在珠孔端;蛋黄形成了一层灰色或附近的另一端。 图3。示意图描述的过程。左：没有蛋壳的胚胎放在琼脂平板上，用针推入孔在琼脂。这种安装在所有胚胎的一致方向的结果，与前结束。右：离心后，胚胎是分层的。琼脂覆盖TSS（蓝色），胚胎从琼脂针收回。 TSS的暂停后，胚胎可以拿起一个移液器。 图4。亮光影像生活果蝇胚胎，他们怎么会出现在步骤4.1相似。胚胎标准方向：前年底到左边，正确的，背的一面朝上，腹侧下来后结束。一个早期胚胎发育的时间间隔短片，作为本议定书所附的视频的一部分。 A.卵裂阶段的胚胎出现均匀的棕色。像这样的阶段是理想的体内离心。 B.胚胚胎有一个清晰的轮辋的出现在各方面相似。这个清晰的边缘，部分原因是由于积累的原子核在细胞膜和部分由于卵黄泡和脂滴7外来运输。这个明确的外围扩展，直至接近 cellularization 1月底。胚胎仍然可以成功地通过离心分层cellularization 8月底之前，虽然蛋黄和原子核的层次感不卵裂阶段一致。 C.后cellularization，胚胎出现不对称;成为独特的背，腹两侧，以及各种褶皱的发展。显示胚胎在早期生殖波段扩展。在这些阶段，离心分层的主要细胞器不再有效。 图5。离心胚胎。在此图中的所有胚胎离心其前结束，并在该方向显示。 A.亮光的形象，一个成功的离心胚胎。在很前结束的棕色层是由于脂滴的积累。一个广阔的后部附近的灰层是由于蛋黄囊泡。经常有一个来历不明的，下面的蛋黄层明确区。淡黄色的区域往往是明显的蛋黄层之上，它可能是线粒体。可溶性蛋白的发现整个清晰的层之间的脂滴和蛋黄2。 B.胚胎在一个由紫外线激发下epifluorescence显微镜观看。蛋黄的蓝色自体荧光的特性，有助于确定后结束。 C.胚胎生殖波段扩展，即在离心后cellularization。蛋黄仍可能积聚在后结束，但另有分层是最小的。 D.成功分层胚胎后，热固定。脂滴层出现白色，蓬松，而不是在不固定的胚胎暗棕色（一）的。 E.＆F胚胎表达His2Av – GFP和成像共聚焦显微镜（修改后2）。电子邮件：离心裂解阶段; His2Av – GFP似乎只标记的脂滴层，因为这个时候形成的几个核。根据焦平面上，细胞核可刚下液滴层可见（此处未显示）。传真：离心胚阶段; His2Av – GFP标记的脂滴层（顶部）和细胞核（在液滴层以下的广阔地带）。