I. Förberedelse av glas Mikropipetter Fylld med fluorescerande mikrokulor för ependymceller Flow-analys (dessa steg kan hoppas över om förberedelserna wholemounts för färgning endast). Säkert en Wiretrol 5 ul av glas kapillärrör på glas mikropipett avdragare och justera värmare och magnetventil inställningar för att dra pipett med en mjuk, grunt kona. Bifoga en källa till positiv lufttryck på slutet av drog mikropipett och försiktigt sänka spetsen på pipetten på en metall galler yta i 45 ° vinkel för att skapa en fasad spets. Positivt lufttryck hjälper till klarglas skräp från insidan av pipetten. Rengör slutet av det avfasade spetsen med en etanol-fuktad vävnad. Undersök pipetten under ett mikroskop med en mikrometer. Spetsen ska ha en jämn fasning med en inre öppning diameter ~ 100 um. Mindre diameter kan användas, men resulterar ofta i igensättning av pipetten med fluorescerande pärlor. Återfyllning pipett med mineralolja tills halv-full, sedan in fett-doppade kolven i bakre pipetten. Advance menisk av mineralolja till pipettspetsen genom att manuellt trycka in kolven. Säkra mikropipett och kolven på en mikromanipulator och skruva sedan innehavaren mikromanipulator pipetten på en liten stationär arm med justerbar höjd. Tidigarelägga pipetten med fluorescerande microbead lösningen, som består av 50% fluorescerande microbead stamlösning, 45% vatten och 5% glycerol. Glycerol läggs för att öka densiteten i en lösning så att när deponeras på wholemount den mikrokulor sjunker på ytan. Placera mikromanipulator på ett säkert ställe där nålen inte råkar brytas och gå vidare med wholemount dissekering. II. Wholemount Dissection och fixering För att förbereda wholemount dissektion, varma tillräcklig mängd L-15 Leibovitz media till 37 ° C. Du kommer att behöva ca 10 ml per djur du planerar att dissekera. Också samla alla tillbehör du behöver för dissekering och fixering av stereomikroskop: sax, tandad stor pincett, slät fin pincett, Sharpoint 22,5 ° mikrokirurgisk sticka kniv, dissekera maträtt, hushållspapper, biohazard väska, och en 24 brunnar på is fylld med 4% paraformaldehyd med eller utan 0,1% Triton X-100. Triton X-100 används för att minska ytspänningen på PFA-lösning, vilket minskar förekomsten av klippning wholemount ytan när sänka ner den i denna lösning. Häll 50-10 ml av det uppvärmda materialet i en dissekera maträtt hänförs till ett fluorescerande stereomikroskop. Analysera rätter tillagas genom att hälla en elastisk polymer, kallad Sylgard 184, till en 6 cm plast skål och låta polymerlösning botemedel för 1 vecka under vakuum och därefter noggrant skölja disken i stora mängder vatten innan det används. Vanligtvis låter vi disken blöt i vatten i en 1 L bägare under 1 vecka. Djuret offras av halsdislokation och huvudet avskuret. OBS: Om så önskas kan blodet tas bort från kärlsystemet av perfusing djuret med fysiologisk koksaltlösning före dissekera ut hjärnan. Detta är särskilt viktigt om du utför kromogent immunfärgning med Diaminobenzidin (DAB). En mittlinjen snitt görs, posteriort främre, längs hårbotten att avslöja skallen. En serie av 4 nedskärningar i skallen är gjorda för att öppna kraniet: en klippa spänner över två banor främre till lukt lökar, de två kommande nedskärningar är sämre än lillhjärnan och separera kraniet från skallbasen, och Final Cut går bakre till främre längs mitten sagittala sutur. Den kraniella flikarna är försiktigt tillbaka och hjärnan utvinns och placeras i dissekera skålen. Resten av dissektion utförs under stereomikroskop. Först är det luktsinnet lökar dissekerade bort från hjärnan. Om du vill dessutom undersöka lukt lökar, helt enkelt fixa dem genom nedsänkning i 4% PFA över natten och du kan sedan förbereda dem för snittning och färgning. Dela hjärnan längs interhemispheric spricka. En koronalt-orienterad cut görs sedan vid den bakre-mest aspekten av interhemispheric spricka, vilket gör att stjärtfenan hippocampus som ska visualiseras i tvärsnitt. Hippocampus, som utgör den mediala väggen i laterala ventrikeln i detta läge, måste då vara befriad från överliggande cortex, som utgör dorsal-laterala vägg av kammaren. Först är kniven in i den lilla ventrikulära utrymmet mellan cortex och hippocampus dorsalt, och en minskning sker i hjärnbarken, där den speglar ventralt, bort från mittlinjen, att gå med i hippocampus. Efter detta klipp är gjord, kan cortex vara långsamt skalas bort från hippocampus för att avslöja den laterala ventrikeln flyttar från rygg till ventrala. Denna manöverpåskyndas genom att skära bort en kil av cortex i hörnet där hippocampus släpptes. Efter att ha nått den ventrala-mest omfattningen av den laterala ventrikeln i detta läge, kan du visualisera antingen eller känner där hjärnbarken igen sjal runt, denna gång som reflekteras tillbaka medialt, att gå med i hippocampus. En annan klippa måste göras i detta läge att helt släppa hippocampus eller mediala väggen i den laterala ventrikeln från cortex eller sidovägg av den laterala ventrikeln. Det blir då lätt att dra hippocampus bort från cortex, medialt och anteriorly, för att öppna den laterala ventrikeln mycket. Fortsätt att försiktigt dra i hippocampus anteriorly med hjälp av små streck av pincett och kniv för att dra mediala och laterala väggar isär. När motståndet mot denna indragning börjar öka, är ytterligare nedskärningar behövs. Först, för att öka din exponering mot den laterala ventrikeln och i synnerhet den laterala väggen och SVZ, dissekera bort cortex. Cortex är snyggt dissekeras bort genom att visualisera gränssnittet mellan corpus callosum och VZ / SVZ. Helt enkelt klippa längs detta gränssnitt stanna på callosal sidan för att undvika att skada SVZ. För att kunna fortsätta att dra tillbaka mediala väggen bort från sidovägg, finns ytterligare två snitt som behövs: en klippa dorsalt där sidovägg, mediala väggen och cortex alla konvergerar, och en skär ventralt där sidovägg, mediala vägg, och Thalamus konvergerar. Med dessa nedskärningar, ger ytterligare mjuk dementi på den mediala väggen den främre-mest omfattningen av den laterala ventrikeln ska öppnas. Rätt belysning är viktigt under hela förfarandet och särskilt i nästa steg där de mediala och laterala väggar är separerade anteriorly. Vid denna anterior position i sidled ventrikeln speglar mediala väggen tillbaka och är kontinuerlig med den laterala väggen. Justera belysning så att skuggor mellan de två väggarna avslöjar denna reflektion punkt, som visas som en dal mellan två väggar. Skär exakt i den här dalen att skilja dessa två väggar. Slutligen, helt utsätta sidovägg genom att ta bort någon överhängande cortex dorsalt och thalamus ventralt. Om förbereder wholemounts för immunfärgning, noggrant överföra wholemount, ventrikeln uppåt från dissektion skålen i en 24-brunnar fyllda med 4% PFA med eller utan 0,1% Triton-X100 för en övernattning fixering vid 4 ° C. För fixering känsliga antigener, kan wholemounts fastställas för kortare perioder. Sedan gå vidare till avsnitt 4 på immunfärgning wholemounts. Om förbereder wholemounts för ependymceller flödesanalys, överföra wholemount till en ren dissektion skål fylld med färska, 37 ° C Leibovitz medium och gå vidare till nästa avsnitt. III. Ependymceller Flödesanalys med fluorescerande mikrokulor Immobilisera wholemount på en ren dissekera skål med 2 insekt stift, en i thalamus och en i främre-dorsal hörn wholemount. Placera basen på den stationära arm håller mikromanipulator bredvid stereomikroskop. Se till att höjd justerbara armen maximalt upphöjs att undvika att bryta nålen mot dissektion skålen. Försiktigt doppa spetsen av nålen i media i ett ependorf röret för att rensa bort mikrokulor som finns på utsidan nålspetsen. Om dessa inte rengörs bort, kan de därefter deponeras på wholemout ytan av misstag under nål positionering och minska den totala kvaliteten på filmen. Placera nålspetsen över ryggens yta sidovägg och sänka armen för att få nålspetsen i mediet. Nålen bör sänkas tills den är precis ovanför laterala väggen. Med nålen i position, justera zoom och fokus på stereomikroskop för att täcka ett önskat fält. Om du kommer att göra en inspelning av ependymceller flödet, börjar hämta bilder just nu. Mata ~ 5 nl i microbead lösningen på ytan av wholemount. När den första bolusdosen av pärlor har rensats bort från ytan genom ependymceller flöde, kan ytterligare omgångar med pärla utmatning utföras. IV. Immunfärgning Wholemounts Wholemounts dissekerade för immunfärgning är nedsänkning-fast över natten i 4% PFA med eller utan 0,1% Triton-X100 vid 4 ° C. Användningen av Triton-X100 är att föredra för antigener som tolererar denna behandling, men kan utelämnas i de fall färgning kvalitet minskat med diskmedel. Följande morgon är PFA aspireras från 24-brunnar och wholemounts tvättas tre gånger i 5 minuter vardera i 0,1 M PBS, med eller utan 0,1% Triton-X100. Liksom tidigare är användningen av Triton-X100 föredra, men måste inte, för alla tvättar i detta protokoll. Under hela detta protokoll, utbyta lösningar över helamontering kräver noggrann aspiration av lösningen från sidan av brunnen. Sedan är det väl fyllas med lösningen med en överföringspipett vinklas så att lösningen sköljer över sidan av också, inte direkt på den wholemount. Var noga med att hålla kammare sidan av wholemount uppåt hela tiden. Kraftfulla pipettering av lösningar kommer ofta vända wholemount. Vi föredrar att byta lösningar över 1 wholemount i taget för att förhindra att vävnad från att torka. Efter tvättning av PFA, är wholemounts inkuberas under 1 timme i rumstemperatur i blockerande lösningen, som innehåller 10% normal get eller åsna serum i 0,1 M PBS med eller utan Triton-X100. Om du använder Triton-X100 för din färgning, kan du välja att använda antingen 2% eller 0,5% Triton-X100 i den blockerande lösningen. Vi använder 2% Triton-X100 när färgning av antigener som kräver djupare antikroppar tränger in i vävnaden, som de antigener som finns i SVZ. Men när färgning av antigener ligger närmare ytan av sidovägg, såsom antigener som finns i den apikala yta ependymceller celler, använder vi 0,5% Triton-X100. Dessutom kan Triton-X100 lämnas ut för cellytan eller andra antigener som tas bort eller ändras av rengöringsmedel. Ta sedan bort den blockerande lösningen och lägga primära antikroppar utspädda i samma blockerande lösningen och inkubera i 24 eller 48 timmar vid 4 ° C. Val av inkubationstiden beror på antigen, liknande val av 0,5% eller 2% Triton. För antigen sitter på ytan av wholemount, 24 timmars inkubation räcker. Men för antigener ligger djupare, som i SVZ, 48 timmars inkubationstid ge bättre resultat. Till exempel, för att studera apikala ytan och basala organ celler som kantar den laterala ventrikeln väggen, fläcken med antikroppar mot β-catenin skall märka cellmembranet, och γ-tubulin, att märka basala organ. Späd mus-anti-β-catenin antikroppar (1:500) och kanin anti-γ-tubulin antikroppar (1:1000) i 0,1 M PBS innehållande 10% normalt get serum och 0,5% Triton-X100. Inkubera vid 4 ° C i 24 timmar. Att färga vuxna neurala stamceller, eller typ cellerna B1, bets den laterala väggen med GFAP antikropp. Späd mus-anti-GFAP antikroppar (1:500) i 0,1 M PBS innehållande 10% normalt get serum och 2% Triton-X100. Inkubera vid 4 ° C i 48 timmar. Primära antikroppar tvättas bort initialt med 2 snabba sköljningar i PBS med eller utan 0,1% Triton-X100. Gör sedan 3 extra tvättar i 20 minuter i rumstemperatur. Späd sekundära antikroppar i samma blockerande lösningen används för primära antikroppar och lägga till wholemounts inkubera under lika lång tid som för primära antikroppar vid 4 ° C. Till exempel för färgning för β-catenin och γ-tubulin: späd Alexa Fluor 488 get anti-mus antikroppar (1:400, erkänner mus-anti-β-catenin) och Alexa Fluor 594 get-anti-kanin antikroppar (1:400, erkänner kanin anti-γ-tubulin) i 0,1 M PBS innehållande 10% normalt get serum och 0,5% Triton-X100. Inkubera vid 4 ° C i 24 timmar. För GFAP immunfärgning: späd Alexa Fluor 488 get anti-mus antikroppar (1:400, erkänner mus-anti-GFAP) i 0,1 M PBS innehållande 10% normalt get serum och 2% Triton-X100. Inkubera vid 4 ° C i 48 timmar. Sekundära antikroppar tvättas bort från wholemount med samma tvättar utförts för primära antikroppar. Om så önskas kan kärnkraft counter-färgning skall utföras på denna punkt genom inkubering i DAPI spätts i PBS i 30 minuter i rumstemperatur och sedan tvätta en gång i PBS. V. Montering Immunostained Wholemounts på objektglas för konfokalmikroskopi För högupplösta konfokala imaging, efter immunfärgning de wholemounts behövde sub-dissekeras för att bevara endast de laterala väggen av den laterala ventrikeln som en flisa av vävnad 200-300 um tjock. Separera sidovägg från underliggande striatum gör att den kan monteras på en bild och täcks med ett täckglas på en platt sätt. Återvänd till stereomikroskop med immunostained wholemounts och följande verktyg och utrustning: slät fin pincett, Sharpoint 22,5 ° mikrokirurgisk sticka kniv, dissekera maträtt, objektglas och täckglas, 0,1 M PBS, och Aquamount monteringsmedel. Överför wholemount från 24-brunnar till dissekera maträtt innehållande 0,1 M PBS var noga med att hålla ventrikeln uppåt. Först, helt ta bort rygg cortex av wholemount från bakre till främre genom att skära exakt längs linjen där corpus callosum möter sidovägg. Detta erkänns som gränssnitt mellan callosal vita substansen och den rosa-framträdande SVZ. Gör sedan en lång horisontellt orienterad spänner över de ventrala delen av wholemount. Denna snittyta kommer att ge en plattform på vilken man kan stabilize den wholemount under nästa steg i dissekering. Med den dorsala ytan av wholemount uppåt, kommer du att kunna visualisera tjocklek SVZ från främre till bakre längs laterala väggen. Observera att denna syn blev möjligt av den ursprungliga borttagning av hjärnbarken låta den underliggande striatum och SVZ att se. Den SVZ identifieras som den tunna band av vävnad som sträcker sig från ventrikulära ytan till striatum. Den SVZ har en homogen rosa utseende medan striatum är infiltrerats av rep av vit substans. Observera att SVZ är tjockare anteriorly och blir successivt tunnare posteriort. När du har identifierat gränssnitt SVZ och striatum, försiktigt börjar såga i detta gränssnitt på den främre-mest aspekten av sidovägg, föra kniven från rygg till ventrala. För att göra detta korrekt, stabilisera wholemount med pincett som används som två stift. Du kan också använda din pincett till svagt vända wholemount att visualisera bladet avancera från rygg till ventrala över sidovägg. Nyckeln till denna dissektion är att den resulterande flisa av vävnad som mycket platt. Detta innebär att när du skär av SVZ från främre till bakre över sidovägg, måste inriktningen på de nedskärningar som du gör förblir parallell med ventrikulära ytan hela tiden. Kom ihåg att mer posteriort blir SVZ tunnare. Hellre än att tunna ut din dissekering för att skära av bara SVZ vid denna punkt, är det viktigt att när du avancerar posteriort förblir tjocklek vävnad som dissekeras samma. Detta kommer att säkerställa att flisa av vävnaden du kommer därefter montera är platt. Efter att helt separera sidovägg från underliggande striatum, försiktigt bort allt omkringliggande vävnader från denna flisa som inte är en del av ventrikulära väggen. Sedan plocka upp denna flisa underifrån med hjälp av pincett och placera den i mitten av ett objektglas. Applicera ett par droppar aquamount direkt på wholemount och försiktigt placera ett täckglas centrerad över detta, försöker att inte införa bubblor på ytan av vävnaden. Vikten av bilden kommer att säkerställa att aquamount sprider jämnt och kommer att producera en raffinerad flackare laterala väggen. Mängden aquamount används och storleken på täckglas beror på ålder vävnad som dissekeras. För embryonala och tidiga postnatala vävnader, föredrar vi en droppe aquamount och en 22 "x 30" täckglas. Tyngre täckglas kan snedvrida vävnaden och mer aquamount kommer att störa bildkvalitet eftersom konfokala lasrar kommer att ha sämre förmåga att tränga in i ett tunt lager av aquamount bor mellan täckglas och vävnaden ytan. För senare efter födsel och vuxna vävnader, använder vi 4 droppar aquamount och en 24 "x 60" täckglas. Bilderna lagras sedan plant i en bild bok vid 4 ° C i 1-2 dagar innan avbildning så att täckglasen att bosätta sig. Representativa resultat Wholemount metoder har gett flera viktiga insikter i stilbildande aktivitet vuxna SVZ. Nätverket av kedjor av flyttande unga nervceller i SVZ observerades först efter wholemounts av den laterala väggen av den laterala ventrikeln var immunostained med antikroppar mot polysialylated neurala celladhesionsmolekyl (PSA-NCAM) 1. Dessa kedjor av flyttande neuroblaster kan också ses efter immunfärgning wholemounts med doublecortin antikroppar (Figur 1). Anmärkningsvärt, har nätverket av kedjorna ett stereotypt mönster, med två allmänna strömmar av celler, en kör dorsalt över och en kör ventralt runt vidhäftning punkten. Wholemounts av SVZ ger också en helhetssyn på proliferativ aktivitet stamceller i denna region, som ses med Ki67 färgning i figur 2. Intressant, två nya studier tyder på en nära samverkan mellan dela SVZ celler och den lokala kärlsystemet 2,3 (figur 2). Då undersöks under hög effekt konfokalmikroskopi, tillåter en-ansiktet uppfattning som wholemounts ett unikt perspektiv på den apikala ytan av celler som kantar ventrikulära systemet. Detta sv-ansikte perspektiv har nyligen avslöjat att SVZ typ B1 celler, den vuxna neurala stamceller, är en del av en blandad neuroepithelium med icke-dela differentierade ependymceller celler 4. Den apikala ytan av celler av typ B1 kontakter de laterala ventrikeln och är omgiven av stora apikala ytan av ependymceller celler i en vindsnurra konfiguration (Figur 3, pilarna visar B1 apikala ytor). Dessutom har närmare granskning av den apikala yta ependymceller celler visade att translationell position och rotations riktning av deras basala kroppar är indikatorer på sina plana polaritet 5. Ependymceller basala bodör är grupperade i en fläck på den apikala ytan. Denna patch är fördrivna från centrum av den apikala ytan i nedströms "riktning med avseende på CSF flödet (translational polaritet), inom denna patch är varje basala kroppen vridits runt sin längdaxel så att den basala foten, ett tillbehör till de basala kropp, pekar i flödesriktningen (roterande polaritet). Grannlandet ependymceller celler har sina basala kroppar orienterade i samma riktning. viktigare, kan videomicrographs av ependymceller flödet analysen användas för att direkt jämföra flödet i en viss region av sidovägg till orientering ependymceller basala organ i den regionen (Figur 4). Förutom att ge en övergripande bild av de största germinalcenter regionen i den vuxna hjärnan, med högre effekt bildbehandling, wholemounts möjliggöra en mer komplett och detaljerad analys av enskilda cellulära morfologier i SVZ. Hög effekt konfokal avbildning av GFAP immunfärgning på wholemounts har visat att typ B1 celler, förutom sina korta ventrikeln-kontakt apikala process har en lång basala process i kontakt med blodkärl (Figur 5) 4. Detta cytoarchitecture hade inte varit uppskattat tidigare i koronala avsnitt eftersom de basala körs oftast parallellt med ventrikulära väggen. Serial sektionering skär därför enskilda celler i små fragment, vilket gör det nästan omöjligt att rekonstruera en cell är komplett morfologi, eller att förstå dess relation till andra typer av celler i SVZ. Den wholemount metoden har flera fördelar jämfört med klassiska sektionering tekniker, både att ge panoramautsikt med låg effekt mikroskopi och en komplett perspektiv enskilda celler med hög effekt mikroskopi. Denna teknik kommer att fortsätta vara ett viktigt komplement till framtida studier av denna vuxna hjärnan embryon zon. Figur 1. Nätverk av flyttande neuronala kedjor i SVZ. Kaklat konfokala bilder rekonstruera en sidovägg wholemount som färgas med antikroppar mot doublecortin, vilka etiketter vandrar neuroblaster hela SVZ. Det finns två allmänna strömmar av invandring, en kör dorsalt över och en kör ventralt runt vidhäftning punkten, anges med asterisk (*). Pilar indikerar främre (a) och rygg (d) riktningar. Skala bar = 1 mm. Figur 2. Förhållandet mellan kärlsystemet och dela celler i SVZ. Detta sidovägg wholemount var immunostained med antikroppar för Ki67, att märka delande celler i grönt, och antikroppar mot mus immunoglobuliner, att märka kärlsystemet i rött. Eftersom denna wholemount inte perfusion med koksaltlösning innan färgning, den endogena mus-IgG-molekyler kvar i blodkärlen och fläckas av sekundära anti-mus antikroppar. Senaste arbete tyder på att dela SVZ prekursorer (grön) ligger i närheten av blodkärl (röd) {Shen, 2008 # 6523} {Tavazoie, 2008 # 6522}. Pilar indikerar främre (a) och rygg (d) riktningar. Skala bar = 1 mm. Figur 3. Apikala yta ventrikeln-kontakt celler på den laterala väggen. Hög effekt konfokala bild av en wholemount immunostained för β-catenin skall märka cellmembran i grönt, och γ-tubulin, att märka basala organ i rött, avslöjar plana organisationen av dessa epitelceller. Typ B1 celler, den vuxna neurala stamceller, har en liten apikala yta med en basal kropp, indikeras av pilar. Den apikala ytan av dessa celler omges av stora apikala yta ependymceller celler i en vindsnurra konfiguration. Ependymceller celler har plana polaritet anges av positionen av flera basala kroppar på apikala ytan. Grannlandet ependymceller celler har sina basala kropp kluster ligger på samma sida av apikala yta (nedåt och åt vänster i denna region), vilket motsvarar riktningen av CSF flödet {Mirzadeh, 2010 # 6573}. Skala = 10 mikrometer. Figur 4. Ependymceller flöde analys. Sammansatt bild som skapats genom sammanslagning av 100 sekventiella bildrutor från en film som tagits under ependymceller flödet analysen. Lysrör mikrokulor deponeras rygg-och posteriort om vidhäftning området var som drivs av ependymceller flimmerhår i två orienterade strömmar, en över och en under vidhäftning, mot foramen av Monro. Detta orienterad flöde avslöjar den funktionella plana polaritet ependymceller celler. Varje flöde linjen visar läget av en enda pärla på varandra följande tidpunkter. Skala bar = 0,5 mm. <p class="jove_content"> Figur 5. GFAP + typ B1 celler har en lång basal fiber med slutet av fötterna på blodkärl. Maximal projektion av en hög effekt konfokala stacken tas från en sidovägg wholemount immunostained med GFAP antikroppar mot etiketten SVZ astrocyter. Denna färgning etiketter vuxna neurala stamceller, eller typ cellerna B1, som har en apikal slutade på ventrikulära ytan, och som här, en lång GFAP + basala fiber som slutar på blodkärl (pilar). Blodkärl färgas här eftersom den sekundära antikroppen som används för att visualisera mus-anti-GFAP antikropparna känner igen kroppsegna mus-IgG i kärlsystemet. Skala bar = 50 ìm.
