I. Подготовка стекла Микропипетки Заполненный флуоресцентные микрошарики для эпендимальных Анализ потока (эти шаги могут быть пропущены при подготовке wholemounts для окрашивания целей). Безопасные Wiretrol 5 мкл капиллярной трубке стекла на стеклянные микропипетки съемник и отрегулировать обогреватель и электромагнитные параметры тянуть пипетки с гладкой, мелкий конус. Присоединить источник положительного давления воздуха на конце вытащил микропипетки и осторожно опустите кончик пипетки на поверхность решетки металла на угол 45 ° для создания скошенных чаевые. Положительное давление воздуха помогает очищать стекла от мусора внутри пипетки. Чистая конце скошенный наконечник с этанолом смоченной тканью. Изучить кончика пипетки под микроскопом с помощью микрометра. Наконечник должен иметь гладкую конические с внутренним диаметром открытия ~ 100 мкм. Меньшие диаметры могут быть использованы, но часто приводит к закупорке пипетки с люминесцентными бисером. Засыпка пипетки с минеральным маслом, пока наполовину полон, а затем вставить смазкой погружать поршень в задней пипетки. Advance мениска нефтепродуктов на кончике пипетки вручную, нажимая на поршень. Безопасные микропипетки и поршень на микроманипулятора, то винт держателя микроманипулятора пипетки на небольших стационарных руку с регулируемой высотой. Передняя пипетки с люминесцентными решение Microbead, состоящий из 50% флуоресцентными маточного раствора Microbead, 45% воды и 5% глицерина. Глицерин добавляется к увеличению плотности раствора, чтобы, когда наносились на wholemount микрошарики раковину на поверхность. Место микроманипулятора в безопасное место, где игла не будет случайно сломан и приступить wholemount рассечение. II. Wholemount Разбор и фиксации Для подготовки к wholemount диссекции, теплыми достаточное количество L-15 Лейбовиц средств массовой информации до 37 ° C. Вам понадобится около 10 мл на животное вы собираетесь анализировать. Также соберите все поставки Вам будет необходимо для рассечения и фиксации стереомикроскопа: ножницы, щипцы большие зубчатые, гладкие штраф щипцы, Sharpoint 22,5 ° микрохирургических удар ножом, рассекая блюдо, бумажное полотенце, биологически опасных сумку, и 24-луночный планшет на льду заполнены 4% параформальдегида с или без 0,1% Тритон Х-100. Тритон Х-100 используется для уменьшения поверхностного натяжения раствора PFA, что снижает заболеваемость стрижки wholemount поверхности при погружении его в этом решении. Налейте 5-10 мл нагревается СМИ в рассекает блюдо под флуоресцентным стереомикроскопа. Пройдя блюда готовятся при заливке эластичного полимера, называемого Sylgard 184, на 6 см пластиковые тарелки и дать лекарство раствора полимера в течение 1 недели в вакууме, затем тщательно полоскание блюд в больших объемах воды перед использованием. Как правило, мы позволяем блюда замочите в воде на 1 л стакан в течение 1 недели. Животное, принесенных в жертву шейки дислокации и голова отрезана. Примечание: При желании, крови могут быть удалены из сосудистой перфузии на животных с физиологическим раствором до вскрытия из мозга. Это особенно важно, если выполнение хромогенных иммуноокрашивания с диаминобензидина (DAB). Срединный разрез делается, задней к передней, а кожа головы выявить черепа. Серия из 4 сокращений в черепе сделаны, чтобы открыть черепа: один вырезать охватывает два круга впереди обонятельных луковиц, в ближайшие два сокращения уступают мозжечке и отдельных черепа от основания черепа, и окончательный вариант работает кзади от передней вдоль середины сагиттального шва. Черепной заслонки мягко отказался и мозг извлекается и помещается в рассекает блюдо. Остальная часть вскрытие проводится под стереомикроскопа. Во-первых, обонятельные луковицы расчлененный от мозга. Если вы хотите дополнительно изучить обонятельных луковиц, просто их исправить путем погружения в 4% PFA в ночное время и вы, может впоследствии подготовить их для секционирования и окрашивания. Разделите мозга по межполушарной щели. Коронки ориентированных Затем производится разрез по задне-самый аспект межполушарной щели, позволяющая хвостового гиппокампе, чтобы быть визуализированы в поперечном сечении. Гиппокамп, который образует медиальной стенки бокового желудочка в этой позиции, должны быть освобождены от вышележащих коры, образующей спинно-боковой стенке желудочка. Во-первых, нож вставляется в небольшое пространство между желудочков мозга и гиппокампе в верхней части, и надрез в коре головного мозга, где он отражает снизу, от средней линии, чтобы присоединиться гиппокампе. После этого разрез сделан, кора может быть медленнее, очищенные от гиппокампа выявить бокового желудочка переход от спины к брюху. Этот маневрускоренные, отрезая клин коры в угол, где гиппокамп был освобожден. После достижения вентральной-самых степень бокового желудочка в этой позиции, вы можете либо визуализировать или почувствовать, где кора снова оборачивается вокруг, на этот раз отраженным медиально, вступать в гиппокамп. Другой срез должен быть сделан в таком положении, чтобы полностью освободить гиппокампе и медиальной стенки бокового желудочка от коры или боковой стенке бокового желудочка. Затем он будет легко вытащить гиппокампа от коры, медиально и вперед, чтобы открыть бокового желудочка широко. Продолжайте осторожно потяните вперед гиппокамп с помощью небольших ударов пинцетом и ножом отказаться от медиальной и боковыми стенками друг от друга. Как только сопротивление этому опровержение начинает расти, дополнительные сокращения необходимы. Во-первых, увеличить воздействие бокового желудочка и, в частности, боковые стенки и СВЗ, рассекают от коры головного мозга. Коры чисто расчлененный езды на визуализации интерфейса между мозолистого тела и VZ / СВЗ. Просто разрезать вдоль этот интерфейс пребывания на каллозальные сторону, чтобы не повредить СВЗ. В целях дальнейшего втягивания медиальной стенки от боковой стенке, еще два сокращения необходимы: одно сокращение сверху, где боковые стены, медиальной стенки, а кора все сходятся, и одного разреза брюшной стороне, где боковые стены, медиальной стенки, и таламус сходятся. С помощью этих сокращений сделал, далее нежный опровержение на медиальной стенке позволяет передне-самых степень боковой желудочек должен быть открыт. Правильное освещение имеет важное значение на протяжении всей процедуры и особенно в следующем шаге, где средние и боковые стены разделены спереди. На этом передние позиции в боковой желудочек, медиальная стенка отражает обратно и непрерывна боковой стенке. Отрегулируйте освещение так, что тени между двумя стенами раскрыть это отражение точка, которая выглядит как долине между двумя стенами. Вырезать именно в этой долине, чтобы разделить эти две стены. Наконец, полностью разоблачить боковой стенке, удалив все нависающие кора сверху и снизу таламус. При приготовлении wholemounts для иммунной, тщательно передачи wholemount, желудочка стороной вверх, от вскрытия блюдо в 24-луночного планшета заполнены 4% PFA или без 0,1% Triton-X100 для фиксации ночь при 4 ° C. Для фиксации чувствительных к антигенам, wholemounts может быть установлен на более короткие периоды времени. Затем переходите к разделу 4 на иммунной wholemounts. При приготовлении wholemounts для эпендимальных анализа потока, передачи wholemount на чистую блюдо рассечение заполнены свежими, 37 ° C среда Лейбовиц и перейти к следующему разделу. III. Эпендимальных Анализ потока с использованием флуоресцентные микрошарики Остановите wholemount на чистую рассекает блюдо с использованием 2 насекомых булавками, один в таламус и один в передне-спинной углу wholemount. Место базе стационарных рука, держащая микроманипулятора рядом с стереомикроскопа. Убедитесь, что высота регулируемая руку максимально повышенных, чтобы избежать нарушения иглу против вскрытия блюдо. Осторожно опустите кончик иглы в СМИ в трубке ependorf счистить микрошарики, которые присутствуют на внешних кончике иглы. Если они не убираются прочь, они могут быть впоследствии осаждается на поверхности wholemout случайно во время позиционирования иглы и снизить общее качество фильма. Поместите кончик иглы на дорсальной поверхности боковых стен и нижнюю руку, чтобы принести иглы в среду. Игла должна быть снижена, пока не будет чуть выше боковой поверхности стены. С иглой в положении, отрегулируйте зум и фокус на стереомикроскопа для покрытия нужного поля. Если вы будете делать записи эпендимальных потока, начинают получения изображения в это время. Извлечь ~ 5 п от Microbead раствор на поверхность wholemount. После начального болюсного из бисера была очищена от поверхности эпендимальных потока, дополнительные раунды бусинка выброса может быть выполнена. IV. Иммуноокрашивание Wholemounts Wholemounts расчлененный для иммунной являются погружения фиксированной в течение ночи в 4% PFA или без 0,1% Triton-X100 при 4 ° C. Использование Triton-X100 является предпочтительным для антигенов, что терпеть это лечение, но могут быть оставлены в тех случаях, когда качество окрашивания уменьшается на моющие средства. На следующее утро, PFA всасывается из 24-луночного планшета и wholemounts промываются 3 раза по 5 минут каждый в 0.1 М PBS с или без 0,1% Triton-X100. Как и прежде, использование Triton-X100 является предпочтительным, но не является обязательным для всех моет в этом протоколе. На протяжении всего этого протокола, обмена решениями по всейкрепление требует тщательного стремление решение со стороны хорошо. Затем, также пополняется с решения с использованием передачи пипетки угловой таких, что решение смывает за борт так, а не непосредственно на wholemount. Позаботьтесь, чтобы сохранить желудочка стороне wholemount вверх во все времена. Энергичный пипетирования решений часто флип wholemount. Мы предпочитаем обмениваться решения более 1 wholemount в то время, чтобы предотвратить ткани от высыхания. После смывания PFA, wholemounts инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре в блокировании раствор, содержащий 10% нормальной козьей или осла сыворотке в 0,1 М PBS с или без Triton-X100. При использовании Triton-X100 для окрашивания, вы можете использовать либо 2% или 0,5% Triton-X100 в блокировании решения. Мы используем 2% Triton-X100, когда окрашивание на антигены, которые требуют более глубокой антител проникновения в ткань, таких как антигены находятся в СВЗ. Однако, когда окрашивание на антигены расположены ближе к поверхности боковой стенке, таких как антигены находятся в апикальной поверхности клетки эпендимальных, мы используем 0,5% Triton-X100. Кроме того, Triton-X100 можно не использовать для клеточной поверхности или других антигенов, которые будут удалены или изменены моющего средства. Затем удалите блокирующий раствор и добавить первичных антител разводят в тот же блокирующий раствор и выдержать в течение 24 или 48 часов при температуре 4 ° C. Выбор инкубационного периода зависит от антигена, похожие на выбор 0,5% или 2% Тритона. Для антигенов находится на поверхности wholemount, 24 часа достаточно инкубации. Тем не менее, для определения антигенов расположена глубже, например, в СВЗ, 48-часовой период инкубации обеспечить лучшие результаты. Например, для изучения апикальной поверхности тела и базальных клеток, выстилающих боковой стенки желудочка, пятно с антителами к β-катенина, для обозначения клеточной мембраны, и γ-тубулина, чтобы маркировать базальных тел. Развести мыши анти-β-катенина антител (1:500) и кроличьих анти-γ-тубулина антител (1:1000) в 0.1 М PBS, содержащего 10% нормальной козьей сывороткой и 0,5% Triton-X100. Инкубируйте при 4 ° С в течение 24 часов. Для окраски взрослых нервные стволовые клетки, или клетки типа B1, пятно боковой стенке с антителами GFAP. Развести мыши анти-GFAP антител (1:500) в 0.1 М PBS, содержащего 10% нормальной козьей сывороткой и 2% Triton-X100. Инкубируйте при 4 ° С в течение 48 часов. Первичные антитела смывают сначала на 2 быстрой промывки в PBS с или без 0,1% Triton-X100. Затем сделайте еще 3 моет в течение 20 минут каждый при комнатной температуре. Развести вторичными антителами в том же блокирующий раствор, используемый для первичного антитела и добавить в wholemounts для инкубации за тот же период времени в качестве первичных антител при 4 ° C. Например, для окрашивания β-катенина и γ-тубулина: разбавьте Alexa Fluor 488 козьего анти-мышиных антител (1:400, признает мыши анти-β-катенина) и Alexa Fluor 594 козьего анти-кролик антител (1:400, признает кроличьих анти-γ-тубулина) в 0,1 М PBS, содержащего 10% нормальной козьей сывороткой и 0,5% Triton-X100. Инкубируйте при 4 ° С в течение 24 часов. Для GFAP иммуноокрашивания: разбавьте Alexa Fluor 488 козьего анти-мышиных антител (1:400, признает мыши анти-GFAP) в 0,1 М PBS, содержащего 10% нормальной козьей сывороткой и 2% Triton-X100. Инкубируйте при 4 ° С в течение 48 часов. Вторичные антитела смываются wholemount с использованием тех же моет выполняется для первичных антител. При желании ответного ядерного окрашивание может быть выполнена в этот момент в стадии инкубационного периода DAPI разводят в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем мытье один раз в PBS. В. Монтаж Immunostained Wholemounts на слайды для конфокальной микроскопии Для изображений с высоким разрешением конфокальной, после иммуноокрашивания wholemounts необходимо суб-расчлененный сохранить только боковой стенке бокового желудочка, как кусочек ткани 200-300 мкм. Разделение боковой стенке от основной полосатого тела позволяет ему быть установлен на слайд и покрыт покровным в плоской форме. Вернуться в стереомикроскопа с immunostained wholemounts и следующие инструменты и оборудование: гладкий тонкий пинцет, Sharpoint 22,5 ° микрохирургических удар ножом, рассекая блюдо, предметные стекла и покровные стекла, 0,1 М PBS, и Aquamount монтажа среды. Передача wholemount от 24-луночного планшета для вскрытия блюдо, содержащего 0,1 М PBS стараясь не желудочка стороной вверх. Во-первых, полностью удалить спинной коры wholemount от задней к передней, сокращая точно вдоль линии, где мозолистого тела встречается боковой стенке. Это признается в качестве интерфейса между каллозальные белого вещества и розово-появляющиеся СВЗ. Затем сделайте долгий горизонтально ориентированный пересекают вентральной аспект wholemount. Этот отрезок поверхность будет служить платформой, на которую вы можете йabilize wholemount во время следующего шага в рассечение. С дорсальной поверхности wholemount вверх, вы будете в состоянии представить себе толщину СВЗ спереди назад вдоль боковой стены. Обратите внимание, что эта точка зрения стала возможной благодаря начального удаления коры позволяет основной стриатуме и СВЗ не было видно. СВЗ определяется как тонкая полоска ткани простирается от желудочковой поверхности полосатом теле. СВЗ имеет однородный розовый оттенок в то время как стриатума проникли на веревках белого вещества. Обратите внимание, что СВЗ толще вперед и становится все тоньше сзади. После того как вы определили интерфейс СВЗ и полосатом теле, осторожно начинаем резки на этой границе в передне-самый аспект боковой стенке, продвигая нож из спины к брюху. Чтобы сделать это точно, стабилизировать wholemount с пинцетом использоваться как две булавки. Вы также можете использовать ваш пинцет со слегка повернуть wholemount для визуализации лезвия продвижение от спины к брюху через боковые стенки. Ключом к этому является для вскрытия в результате кусочек ткани, которая будет очень плоская. Это означает, что, как вы отрезать СВЗ спереди назад через боковые стены, ориентация сокращений вы должны оставаться параллельно поверхности желудочков во все времена. Помните, что все больше сзади, СВЗ становится тоньше. Вместо того, прореживания ваш рассечение отрезать только СВЗ на данный момент, важно, что по мере продвижения в задней части, толщина ткани будучи расчлененным остается той же. Это гарантирует, что кусочек ткани вы будете впоследствии монтировать плоский. После полного разделения боковой стенке от основной полосатого тела, тщательно удалите все остальные окружающие ткани из этой ленты, которые не являются частью желудочковой стенки. Потом подхватить эту ленту снизу с помощью щипцов и поместите его в центре стекло микроскопа. Нанести несколько капель aquamount непосредственно на wholemount и осторожно положите покровное с центром над этим, пытаясь не вводить пузырьков на поверхности ткани. Вес слайд будет гарантировать, что aquamount рассеивается равномерно и будет производить изысканные уплощение боковой поверхности стены. Количество aquamount используются и размер покровное зависит от возраста ткани быть расчленены. Для эмбрионального и раннего постнатального тканей, мы предпочитаем 1 каплю aquamount и 22 "х 30" покровным. Тяжелые покровные может привести к искажению ткани и более aquamount будет мешать качество изображения, поскольку конфокальной лазеры будут менее способны проникать тонким слоем aquamount проживающих между покровным и поверхности ткани. Для более поздних послеродовых и тканях взрослого организма, мы используем 4 капли aquamount и 24 "х 60" покровным. Слайды, затем храниться в горизонтальном положении в режиме слайд-книги при 4 ° С в течение 1-2 дней до отображения, чтобы позволить покровные, чтобы обосноваться. Представитель Результаты Wholemount подходы предоставили несколько ключевых идей в зародышевых деятельности взрослых СВЗ. Сети цепей миграции молодых нейронов в СВЗ впервые наблюдался после wholemounts из боковой стенке бокового желудочка были immunostained с антителами к polysialylated нейронной молекулы клеточной адгезии (PSA-NCAM) 1. Эти цепочки мигрирующих нейробластов может также рассматриваться после иммуноокрашивания wholemounts с doublecortin антител (рис. 1). Примечательно, что сеть цепей имеет стереотипные модели, с двумя общими потоками клеток, один работает за спинной и один погонный вентрально вокруг адгезии точки. Wholemounts из СВЗ также обеспечивают полное представление о пролиферативной активности предшественников в этом регионе, как это видно с Ki67 окрашивания на рисунке 2. Интересно, что два последних исследований показывают, тесное взаимодействие между делящимися клетками СВЗ и местных сосудистой 2,3 (рис. 2). Когда рассматривается в соответствии с высокой мощностью конфокальной микроскопии, ан-лицо, предоставляемое wholemounts позволяет уникальную перспективу апикальной поверхности клеток, выстилающих желудочковой системы. Это ан-лицо перспектива недавно выяснилось, что СВЗ типа B1 клеток взрослого нервные стволовые клетки, входят в состав смешанных нейроэпителия с неправительственными организациями, разделив дифференцированные клетки эпендимальных 4. Апикальной поверхности клетки типа В1 контакты бокового желудочка и окружен большим апикальной поверхности клеток в эпендимальных конфигурации вертушки (рис. 3, стрелки указывают B1 апикальной поверхности). Кроме того, тщательное изучение апикальной поверхности клетки эпендимальных показало, что поступательное и вращательное позиции ориентации их базальных тел показатели их плоских полярность 5. Эпендимальных клетка базального боумирает сгруппированы в пятно на апикальной поверхности. Этот патч смещается из центра в апикальной поверхности вниз по течению "направления по отношению к CSF потока (поступательное полярности); в этот патч, каждый базальной тело вращается вокруг своей продольной оси так, что базальные пешком, принадлежность базальной орган, указывает в направлении потока (вращательное полярность). Соседние эпендимальных клетки имеют свои базальные тельца ориентированы в одном направлении. Важно отметить, что videomicrographs из эпендимальных анализа потока может быть использован для прямого сравнения потока в конкретном регионе боковой стенке к ориентации эпендимальных клетка базального тела в этой области (рис. 4). В дополнение к предоставлению панорамные точки зрения крупных зародышевых региона во взрослом мозге, с более высокой мощности обработки изображений, wholemounts позволит более полного и подробного анализа отдельных клеточных морфологии в СВЗ. Высокая мощность конфокальной микроскопии в GFAP иммуноокрашивания на wholemounts показало, что клетки типа B1, в дополнение к их коротким желудочка контактирующих апикального процесса, имеют длительный процесс базального в контакте с кровеносными сосудами (рис. 5) 4. Это cytoarchitecture не были оценены ранее в корональных секции, так как базальные процесс выполняется главным образом параллельно желудочковой стенки. Последовательный секционирования поэтому сокращение отдельных клеток на мелкие фрагменты, что делает его практически невозможно воссоздать полную морфологию клетка с, или понять его отношение к другим типам клеток в СВЗ. Wholemount подход имеет несколько преимуществ по сравнению с классическими методами секционирования, как в обеспечении панорамные виды с низкой силовой микроскопии и полной точки зрения отдельные клетки с высокой силовой микроскопии. Эта техника будет оставаться важным дополнением к будущие исследования этого взрослом мозге зародышевого зоне. Рисунок 1. Сеть миграционных нейронных цепей в СВЗ. Плиточные конфокальных изображений реконструировать боковые wholemount стены, окрашивали антителами к doublecortin, какие метки миграции нейробластов всей СВЗ. Есть два основных потоков миграции, один работает за спинной и один погонный вентрально вокруг адгезии точки, обозначенные звездочкой (*). Стрелки указывают передней (а) и спинного (г) направлениях. Шкала бар = 1 мм. Рисунок 2. Связь между сосудистой и деление клеток в СВЗ. Это боковой wholemount стена immunostained с антителами для Ki67, чтобы маркировать делящиеся клетки зеленым цветом, а антитела против иммуноглобулинов мыши, чтобы маркировать сосудистой красным цветом. Потому что это был не wholemount перфузии физиологическим раствором до окрашивания, эндогенные молекулы IgG мыши остаются в кровеносные сосуды и окрашиваются вторичными анти-мышиных антител. Последние исследования показывают, что деление СВЗ прекурсоров (зеленый) расположены в непосредственной близости от кровеносных сосудов (красный) {Шен, 2008 г. № 6523} {Tavazoie 2008 года № 6522}. Стрелки указывают передней (а) и спинного (г) направлениях. Шкала бар = 1 мм. Рисунок 3. Апикальной поверхности желудочка контактирующих клеток на боковой стенке. Высокая мощность конфокальной образ wholemount immunostained для β-катенина, чтобы маркировать клеточных мембран в зеленых и γ-тубулина, чтобы маркировать базального тела в красный, показывает, плоские организации этих эпителиальных клеток. Тип B1 клеток взрослого нервные стволовые клетки, имеют небольшой апикальной поверхности с одним базальным телом, показаны стрелками. Апикальной поверхности этих клеток окружена большим апикальной поверхности клеток в эпендимальных вертушки конфигурации. Эпендимальных клетки плоского полярности указывает положение их несколько базальных тел на апикальной поверхности. Соседние эпендимальных клетки базального их кластеров тела расположены на одной стороне апикальной поверхности (сверху вниз и влево в этом регионе), что соответствует направлению CSF потока {Mirzadeh 2010 # 6573}. Шкала бар = 10 мкм. Рисунок 4. Эпендимальных анализа потока. Композитный образа, созданного путем слияния 100 последовательных кадров из фильмов, принятых в ходе эпендимальных анализа потока. Флуоресцентные микрошарики хранение спинной и сзади адгезии области были в движение с помощью ресничек эпендимальных в двух ориентированных потоков, один над и одна под адгезии, к отверстие Монро. Этот ориентированный поток показывает функциональные плоских полярность эпендимальных клеток. Каждая поточная линия изображает положение одного шарик в последовательные моменты времени. Шкала бар = 0,5 мм. <p class="jove_content"> Рисунок 5. GFAP + клеток типа B1 имеют долгую базального волокна с конечным ноги на кровеносные сосуды. Максимальная проекция высокой мощности конфокальной стек взят из боковых стен wholemount immunostained с GFAP антител к этикетке СВЗ астроцитов. Это окрашивание этикетки взрослых нервные стволовые клетки, или клетки типа B1, которые апикальной заканчивающийся желудочковой поверхности, и, как показано здесь, давно GFAP + базального волокна, которые заканчиваются на кровеносные сосуды (стрелки). Кровеносные сосуды окрашены здесь, потому что вторичные антитела используются для визуализации мыши анти-GFAP антитела распознают эндогенного IgG мыши внутри сосудов. Шкала бар = 50 мкм.
