I. Elaboração de Micropipetas de vidro preenchidos com microesferas fluorescentes para Assay Fluxo ependimárias (esses passos podem ser ignorados se preparando wholemounts para fins de coloração única). Garantir um Wiretrol 5 tubo de vidro sobre vidro capilar ul micropipeta extrator e ajustar as configurações do aquecedor e do solenóide para puxar pipeta com uma vela, liso raso. Anexar uma fonte de pressão de ar positivo para o final da micropipeta puxado e delicadamente abaixar a ponta da pipeta sobre uma superfície grade de metal em um ângulo de 45 ° para criar uma ponta chanfrada. Pressão de ar positiva ajuda a limpar os restos de vidro a partir do interior da pipeta. Limpe o final da ponta chanfrada com etanol-umedecidos tecido. Examine a ponta da pipeta em um microscópio com um micrômetro. A ponta deve ter um chanfro lisa com um diâmetro de abertura interna de ~ 100 um. Diâmetros menores podem ser usados, mas muitas vezes resultam em obstrução da pipeta com miçangas fluorescentes. Backfill pipeta com óleo mineral até meio cheio, em seguida, insira-gordura êmbolo mergulhado nas costas da pipeta. Menisco avanço do óleo mineral para a ponta da pipeta manualmente, empurrando o êmbolo. Assegurar a micropipeta e êmbolo em um micromanipulador, então parafuso o titular da pipeta micromanipulador em um pequeno braço estacionário com altura regulável. Antecipar a pipeta com a solução microbead fluorescentes, composto de 50% de solução fluorescentes microbead estoque, 45% de água e glicerol 5%. Glicerol é adicionado para aumentar a densidade da solução de modo que quando depositados sobre o wholemount o micro afundar na superfície. Coloque o micromanipulador em um lugar seguro onde a agulha não será quebrada acidentalmente e prossiga com dissecção wholemount. II. Dissecação Wholemount e Fixação Para se preparar para dissecção wholemount, quantidade suficiente de morna L-15 Leibovitz media a 37 ° C. Você vai precisar de cerca de 10 ml por animal você pretende dissecar. Também reunir todas as fontes que você precisa para dissecção e fixação pelo estereomicroscópio: tesoura, pinça dentada grande, lisa forceps multa, Sharpoint 22,5 ° microcirúrgica faca facada, prato de dissecação, papel toalha, saco de risco biológico, e uma placa de 24 poços no gelo cheio paraformaldeído a 4%, com ou sem 0,1% Triton X-100. Triton X-100 é usado para diminuir a tensão superficial da solução de PFA, o que diminui a incidência de cisalhamento na superfície wholemount quando imersão nesta solução. Despeje 5-10 ml da mídia aquecido em um prato de dissecação colocado sob um estereomicroscópio fluorescente. Dissecando pratos são preparados por derramar um polímero elástico, chamado Sylgard 184, em um prato de plástico de 6 cm e deixar que a cura para a solução de polímero uma semana sob vácuo, em seguida, enxaguar bem os pratos de grandes volumes de água antes do uso. Normalmente, deixamos os pratos de molho em água num copo L 1 para 1 semana. O animal é sacrificado por deslocamento cervical ea cabeça é cortada. Nota: Se desejar, o sangue pode ser apuradas a partir da vasculatura irrigando o animal com solução salina normal antes de dissecar o cérebro. Isto é particularmente importante se realizar imunocoloração cromogênico com diaminobenzidina (DAB). A incisão é feita na linha média, posterior ao anterior, ao longo do couro cabeludo para revelar o crânio. Uma série de quatro cortes no crânio são feitas para abrir o crânio: um corte abrange as duas órbitas anterior ao bulbo olfatório, os próximos dois cortes são inferiores ao cerebelo e separar o crânio da base do crânio, e corre o corte final posterior para anterior ao longo da sutura médio-sagital. As abas cranianos são delicadamente retraído eo cérebro é extraído e colocado no prato de dissecação. O restante da dissecção é realizada sob o estereomicroscópio. Primeiro, os bulbos olfatórios são dissecados longe do cérebro. Se desejar, adicionalmente, para examinar os bulbos olfativos, basta corrigi-los por imersão em PFA 4% durante a noite e você pode prepará-los para posteriormente corte e coloração. Divide o cérebro ao longo da fissura inter-hemisférica. Um corte coronal-oriented é então feita no aspecto póstero-mais da fissura inter-hemisférica, permitindo que o hipocampo caudal para ser visualizado na seção transversal. O hipocampo, que forma a parede medial do ventrículo lateral nesta posição, deve então ser liberada a partir do córtex suprajacente, que forma a parede dorsal-lateral do ventrículo. Primeiro, a faca é inserida no espaço ventricular pequena entre o córtex eo hipocampo dorsal, e um corte é feito no córtex, onde ele reflete ventralmente, longe da linha média, para se juntar ao hipocampo. Após este corte é feito, o córtex pode ser lentamente descoladas do hipocampo para revelar o ventrículo lateral que se deslocam de dorsal para ventral. Esta manobra éexpedida pela corte de uma cunha do córtex na esquina onde o hipocampo foi lançado. Depois de alcançar o ponto mais ventral do ventrículo lateral nessa posição, você pode tanto visualizar ou sentir onde o córtex envolve novamente, desta vez refletindo medialmente, para se juntar ao hipocampo. Outro corte deve ser feito nesta posição para liberar completamente o hipocampo ou parede medial do ventrículo lateral do córtex ou na parede lateral do ventrículo lateral. Será então fácil de puxar o hipocampo longe do córtex, medial e anteriormente, para abrir o ventrículo lateral amplamente. Continuar a puxar delicadamente o hipocampo anterior usando pequenos acidentes vasculares cerebrais do fórceps e uma faca para retirar as paredes medial e lateral distante. Uma vez que a resistência a essa retração começa a aumentar, os cortes adicionais são necessários. Primeiro, para aumentar a sua exposição para o ventrículo lateral e, em particular, a parede lateral e SVZ, dissecar longe do córtex. O córtex é limpa dissecada, visualizando a interface entre o corpo caloso eo VZ / SVZ. Basta cortar ao longo desta interface de ficar do lado corpo caloso para evitar danificar o SVZ. Para continuar a retrair a parede medial de distância da parede lateral, mais dois cortes são necessários: um corte dorsalmente onde a parede lateral, parede medial e córtex convergem todos, e um corte ventral onde a parede lateral, parede medial, e tálamo convergem. Com estes cortes feitos, retração mais suave na parede medial permite a extensão anterior mais do ventrículo lateral para ser aberto. Iluminação adequada é essencial durante todo o procedimento e, especialmente, na próxima etapa, onde as paredes medial e lateral são separados anteriormente. Nesta posição anterior do ventrículo lateral, a parede medial reflete de volta e é contínua com a parede lateral. Ajustar a iluminação de modo que sombras entre os dois muros revelar este ponto de reflexão, que aparece como um vale entre as duas paredes. Corte exatamente neste vale de separar estas duas paredes. Finalmente, completamente exposição da parede lateral, removendo qualquer córtex dorsal e pendendo sobre o tálamo ventral. Se preparando para a imunocoloração wholemounts, transferir cuidadosamente o lado, wholemount ventrículo-se, desde o prato dissecção em uma placa de 24 cavidades cheias de PFA 4% com ou sem 0,1% Triton-X100 para uma fixação overnight a 4 ° C. Para fixação sensível antígenos, wholemounts pode ser fixado por períodos mais curtos de tempo. Em seguida, avance para a secção 4 sobre wholemounts imunocoloração. Se preparando para a análise do fluxo de wholemounts ependimárias, transferir o wholemount a um prato cheio de dissecação limpa fresca 37 °, C médio Leibovitz e prossiga para a próxima seção. III. Análise de Fluxo de ependimárias utilizando microesferas fluorescentes Imobilizar o wholemount em um prato limpo dissecar usando dois pinos de insetos, uma no tálamo e um em ântero-dorsal canto do wholemount. Coloque a base do braço parado segurando o micromanipulador ao lado do estereomicroscópio. Certifique-se a altura do braço ajustável é maximamente elevados para evitar quebrar a agulha contra o prato dissecção. Mergulhe com cuidado a ponta da agulha nos meios de comunicação em um tubo Ependorf para limpar microesferas que estão presentes na ponta exterior da agulha. Se estes não são limpos de distância, que poderão ser posteriormente depositado na superfície wholemout inadvertidamente durante a agulha de posicionamento e reduzir a qualidade geral do filme. Posição da ponta da agulha sobre a superfície dorsal da parede lateral e abaixe o braço para levar a ponta da agulha no meio. A agulha deve ser reduzida até que seja logo acima da superfície da parede lateral. Com a agulha na posição, ajustar o zoom e foco no estereomicroscópio para cobrir um campo desejado. Se você vai fazer uma gravação do fluxo ependimárias, começar a adquirir imagens neste momento. Eject ~ 5 nl da solução microbead sobre a superfície do wholemount. Uma vez que o bolus inicial de contas tenha sido apagado da superfície pelo fluxo ependimárias, rodadas adicionais de ejeção do talão pode ser realizada. IV. Wholemounts imunocoloração Wholemounts dissecados para imunomarcação imersão são fixos durante a noite em PFA 4% com ou sem 0,1% Triton-X100 a 4 ° C. O uso de Triton-X100 é o preferido para antígenos que tolerar este tratamento, mas pode ser deixado de fora em casos onde a qualidade é diminuído pela coloração detergente. Na manhã seguinte, PFA é aspirado da placa de 24 poços e as wholemounts são lavados 3 vezes por 5 minutos cada em 0,1 M PBS com ou sem 0,1% Triton-X100. Como antes, o uso de Triton-X100 é o preferido, mas não é obrigatório, para todos os lava neste protocolo. Ao longo deste protocolo, a troca de soluções ao longo de todomontagem requer aspiração cuidadosa da solução do lado do bem. Então, o bem é abastecido com solução usando uma pipeta em ângulo tal que a solução lava sobre o lado do bem, não diretamente sobre a wholemount. Tome cuidado para manter o lado do ventrículo wholemount voltada para cima em todos os momentos. Pipetagem vigorosa de soluções, muitas vezes, inverter a wholemount. Nós preferimos soluções de troca de mais de 1 wholemount de cada vez para evitar que o tecido de secagem. Após a lavagem fora da PFA, wholemounts são incubados por 1 hora à temperatura ambiente em solução de bloqueio, contendo 10% ou soro normal de cabra burro em 0,1 M PBS com ou sem Triton-X100. Se estiver usando Triton-X100 para o seu coloração, você pode optar por utilizar a 2% ou 0,5% Triton-X100 na solução de bloqueio. Nós usamos 2% Triton-X100 quando coloração para os antigénios que requerem penetração mais profunda de anticorpos para o tecido, como os antígenos localizados na SVZ. No entanto, quando marcação para antígenos localizados mais próximos à superfície da parede lateral, como antígenos presentes na superfície apical das células ependimárias, usamos 0,5% Triton-X100. Além disso, Triton-X100 pode ser deixado de fora de superfície celular ou outros antígenos que são removidos ou alterados por detergente. Em seguida, remova a solução de bloqueio e adicionar anticorpos primários diluídos na mesma solução de bloqueio e incubar por 24 ou 48 horas a 4 ° C. Escolha do período de incubação depende do antígeno, similar à escolha de 0,5% ou 2% Triton. Para antígenos localizados na superfície do wholemount, basta de incubação de 24 horas. No entanto, para os antígenos localizados mais profundos, como na SVZ, períodos de incubação 48 horas fornecer melhores resultados. Por exemplo, para estudar a superfície apical e órgãos basal das células que revestem a parede do ventrículo lateral, mancha com anticorpos para β-catenina, a etiqueta da membrana celular, e γ-tubulina, de rotular corpos basal. Diluir rato anti-β-catenina anticorpos (1:500) e coelho anti-γ-tubulina anticorpos (1:1000) em 0,1 M PBS contendo soro de cabra 10% normal e 0,5% Triton-X100. Incubar a 4 ° C por 24 horas. Para manchar o adulto de células-tronco neurais, ou células B1 tipo de mancha, a parede lateral com anticorpos GFAP. Diluir rato anti-GFAP anticorpos (1:500) em 0,1 M PBS contendo soro de cabra normal de 10% e 2% Triton-X100. Incubar a 4 ° C por 48 horas. Anticorpos primários são lavados inicialmente por duas lavagens rápidas em PBS, com ou sem 0,1% Triton-X100. Em seguida, fazer 3 lavagens adicionais para cada 20 minutos em temperatura ambiente. Diluir anticorpos secundários na mesma solução utilizada para bloquear anticorpos primários e adicionar à wholemounts para incubar para o mesmo período de tempo como para anticorpos primários, a 4 ° C. Por exemplo, para a coloração de β-catenina e γ-tubulina: diluir Alexa Fluor 488 cabra anti-ratinho (1:400, reconhece mouse anti-β-catenina) e Alexa Fluor 594 cabra anti-coelho anticorpos (1:400, reconhece coelho anti-γ-tubulina) em 0,1 M PBS contendo soro de cabra 10% normal e 0,5% Triton-X100. Incubar a 4 ° C por 24 horas. Para GFAP imunocoloração: diluir Alexa Fluor 488 cabra anti-ratinho (1:400, reconhece mouse anti-GFAP) em 0,1 M PBS contendo soro de cabra normal de 10% e 2% Triton-X100. Incubar a 4 ° C por 48 horas. Anticorpos secundários são lavados fora da wholemount usando a lava mesma realizada para os anticorpos primários. Se desejar, nuclear contra coloração pode ser feita neste momento pela incubação em DAPI diluído em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, lavar uma vez em PBS. V. Montagem Wholemounts imunocoradas em lâminas para microscopia confocal De alta resolução de imagem confocal, seguindo a imunocoloração wholemounts precisava ser sub-dissecados para preservar apenas a parede lateral do ventrículo lateral, um pedaço de tecido 200-300 hum grosso. Separando a parede lateral do striatum subjacente permite que seja montado numa lâmina e coberto com uma lamela de uma forma plana. Voltar ao estereomicroscópio com wholemounts imunocoradas e as seguintes ferramentas e equipamentos: lisa forceps multa, Sharpoint 22,5 ° microcirúrgica faca facada, prato de dissecação, lâminas de microscópio e lamínulas, 0,1 M PBS e meio de montagem Aquamount. Transferir o wholemount da placa de 24 poços para o prato de dissecação contendo 0,1 M PBS tomando cuidado para manter o lado ventrículo up. Primeiro, remova completamente o córtex dorsal do wholemount de posterior para anterior, cortando com precisão ao longo da linha onde o corpo caloso encontra a parede lateral. Esta é reconhecida como a interface entre a matéria calosa branco eo rosa-SVZ aparecendo. Em seguida, fazer um corte horizontal longa-oriented em todo o aspecto ventral do wholemount. Esta superfície de corte irá fornecer uma plataforma no qual você pode stabilize o wholemount durante o próximo passo na dissecção. Com a superfície dorsal do wholemount voltada para cima, você será capaz de visualizar a espessura do SVZ no sentido antero-posterior ao longo da parede lateral. Note-se que esta visão foi possível graças a remoção inicial do córtex permitindo que o striatum subjacente e SVZ para ser visto. A SVZ é identificado como a banda fina de tecido que se estende desde a superfície ventricular para o estriado. A SVZ tem uma aparência homogênea rosa, enquanto o striatum é infiltrada por cordas de substância branca. Note que o SVZ é mais espessa anteriormente e se torna progressivamente mais fino posteriormente. Depois de ter identificado a interface do SVZ e striatum, cuidadosamente começar a cortar a esta interface no aspecto anterior mais da parede lateral, avançando a faca de dorsal para ventral. Para fazer isso com precisão, estabilizar o wholemount com o fórceps usado como dois pinos. Você também pode usar o fórceps para girar o wholemount ligeiramente para visualizar a lâmina avanço da dorsal para ventral através da parede lateral. A chave para esta dissecção é para a lasca resultante de tecido a ser muito plana. Isto significa que, como você fatia fora do SVZ no sentido antero-posterior através da parede lateral, a orientação dos cortes que você faz deve permanecer paralela à superfície ventricular em todos os momentos. Lembre-se que mais posteriormente, o SVZ se torna mais fina. Em vez de diluir a sua dissecção para cortar apenas o SVZ neste momento, é importante que à medida que você avança posteriormente, a espessura do tecido a ser dissecado permanece a mesma. Isso irá garantir que o pedaço de tecido que será posteriormente montagem é plana. Depois de separar completamente a parede lateral do striatum subjacente, remova cuidadosamente todos os outros tecidos ao redor deste sliver que não fazem parte da parede ventricular. Em seguida, pegar esse pedaço de baixo para cima usando o fórceps e posicioná-la no centro de uma lâmina de microscópio. Aplique algumas gotas de aquamount diretamente na wholemount e coloque delicadamente uma lamela centrado sobre isso, tentando não introduzir bolhas na superfície do tecido. O peso do slide irá garantir que o dispersa aquamount uniformemente e irá produzir um achatamento refinado da superfície da parede lateral. A quantidade de aquamount utilizado eo tamanho da lamela depende da idade do tecido a ser dissecado. Para embrionário e início tecidos pós-natal, nós preferimos uma gota de aquamount e um de 22 "x 30" lamela. Lamínulas mais pesado pode distorcer o tecido e mais aquamount irá interferir com a qualidade de imagem porque o laser confocal será menos capaz de penetrar uma camada fina de aquamount que residem entre as lamelas e da superfície do tecido. Para os tecidos mais tarde, pós-natal e adulto, usamos 4 gotas de aquamount e um 24 "x 60" lamela. Os slides são então armazenados apartamento em um livro de slides a 4 ° C por 1-2 dias antes da imagem para permitir que as lamelas de resolver. Resultados representante Abordagens Wholemount forneceram várias informações importantes sobre a atividade germinal da SVZ adulto. A rede de cadeias de migração de neurônios jovens na SVZ foi observada pela primeira vez após wholemounts da parede lateral do ventrículo lateral foram com os anticorpos para moléculas de adesão celular neural polysialylated (PSA-NCAM) 1. Essas cadeias de neuroblastos migram também pode ser visto depois de imunomarcação com anticorpos wholemounts doublecortin (Figura 1). Notavelmente, a rede de cadeias tem um padrão estereotipado, com dois fluxos gerais de células, uma execução mais dorsalmente e ventralmente uma corrida ao redor do ponto de adesão. Wholemounts do SVZ também proporcionar uma visão abrangente da atividade proliferativa de progenitores nesta região, como visto com Ki67 coloração na Figura 2. Curiosamente, dois estudos recentes sugerem uma estreita interacção entre células em divisão e SVZ a vasculatura locais 2,3 (Figura 2). Quando examinados sob microscopia confocal de alta potência, a visão face-en fornecido pelo wholemounts permite uma perspectiva única da superfície apical das células que revestem o sistema ventricular. Esta perspectiva en face revelou recentemente que as células tipo SVZ B1, o adulto de células-tronco neurais, são parte de um neuroepitélio misturado com não-divisão diferenciada células ependimárias 4. A superfície apical de células de tipo B1 contatos do ventrículo lateral e está rodeado por grandes superfícies apicais das células ependimárias em uma configuração de cata-vento (Figura 3, as setas indicam superfícies B1 apical). Além disso, o exame perto da superfície apical de células ependimárias revelou que a posição de translação e rotação de orientação de seus corpos basais são indicadores de sua polaridade planar 5. Ependimárias basocelular boMorre estão agrupados em um remendo na superfície apical. Este patch é deslocado do centro da superfície apical no sentido "a jusante em relação ao fluxo de CSF (polaridade de translação); dentro deste patch, cada corpo basal é girada sobre seu eixo longitudinal de modo que o pé basal, um acessório do basal corpo, aponta na direção de fluxo (polaridade de rotação). vizinhos células ependimárias têm seus corpos basal orientada na mesma direção. Importante, videomicrographs do ensaio fluxo ependimárias podem ser usados para comparar diretamente o fluxo em uma região específica da parede lateral para a orientação de corpos celulares ependimárias basal na região (Figura 4). Além de fornecer uma perspectiva panorâmica da maior região germinal no cérebro adulto, com imagens de maior potência, wholemounts permitir uma análise mais completa e detalhada de cada morfologias celulares no SVZ. Imagem de alta potência confocal de GFAP imunocoloração em wholemounts revelou que as células B1 tipo, para além da sua curta ventrículo entrar em contato com processo apical, têm um longo processo basal em contato com os vasos sanguíneos (Figura 5) 4. Este citoarquitetura não havia sido apreciado anteriormente em cortes coronais, porque o processo corre basal principalmente paralela à parede ventricular. Seccionamento em série, portanto, cortes células individuais em pequenos fragmentos, tornando quase impossível reconstruir a morfologia completa uma célula s, ou de compreender sua relação com outros tipos de células no SVZ. A abordagem wholemount tem várias vantagens sobre as técnicas clássicas de corte, tanto no fornecimento de vistas panorâmicas com microscopia de baixa potência e uma perspectiva completa das células individuais com microscopia de alta potência. Esta técnica continuará a ser um complemento importante para futuros estudos desta zona cérebro adulto germinal. Figura 1. Rede de cadeias migratórias neuronal na SVZ. Azulejos imagens confocal reconstruir uma parede lateral wholemount que foi corado com anticorpos para doublecortin, que rotula neuroblastos migram ao longo do SVZ. Há duas correntes geral de migração, uma execução mais dorsalmente e ventralmente uma execução em torno do ponto de adesão, indicado pelo asterisco (*). Setas indicam anterior (a) e dorsal (d) as direções. Barra de escala = 1 mm. Figura 2. Relação entre a vascularização e células em divisão na SVZ. Este wholemount parede lateral foi com os anticorpos para o Ki67, para rotular células que se dividem em verde, e anticorpos contra imunoglobulinas de camundongo, a etiqueta a vasculatura em vermelho. Porque este não foi wholemount perfundidos com solução salina antes da coloração, as moléculas do mouse IgG endógena permanecem dentro dos vasos sanguíneos e estão manchadas pelo secundário anti-ratinho. Trabalhos recentes sugerem que precursores dividindo SVZ (verde) estão localizados na proximidade de vasos sanguíneos (vermelho) {Shen, 2008 # 6523} {Tavazoie, 2008 # 6522}. Setas indicam anterior (a) e dorsal (d) as direções. Barra de escala = 1 mm. Figura 3. A superfície apical de ventrículo entrar em contato com as células na parede lateral. Imagem de alta potência confocal de um wholemount histoquímica para β-catenina, a rotular as membranas das células em verde, e γ-tubulina, de rotular corpos basais em vermelho, revela que a organização planar dessas células epiteliais. Células do tipo B1, o adulto de células-tronco neurais, têm uma pequena superfície apical com um único corpo basal, indicado por setas. A superfície apical dessas células é cercado pelo grande superfície apical das células ependimárias em uma configuração de cata-vento. Células ependimárias têm polaridade planar indicado pela posição de seus vários corpos basais na superfície apical. Vizinhos células ependimárias ter seus cachos corpo basal situado no mesmo lado da superfície apical (para baixo e para a esquerda na região), correspondente ao sentido da CSF {Mirzadeh, 2010 # 6573} fluxo. Barra de escala = 10 mM. Figura 4. O ensaio de fluxo ependimárias. Imagem composta criado pela fusão de 100 quadros seqüenciais de um filme de tomadas durante o ensaio de fluxo ependimárias. Microesferas fluorescentes depositadas dorsal e posteriormente à área de adesão foram impulsionados por cílios ependimárias em duas correntes orientadas, um em cima e outro para os de adesão, em direção ao forame de Monro. Este fluxo orientado revela a polaridade planar funcional de células ependimárias. Cada linha de fluxo retrata a posição de um talão único em pontos consecutivos no tempo. Barra de escala = 0,5 mm. <p class="jove_content"> Figura 5. GFAP + células B1 tipo têm uma fibra longa basal com o final de pé sobre os vasos sanguíneos. Projeção máxima de uma pilha de alta potência confocal tirada de um wholemount parede lateral com os anticorpos para identificar astrócitos GFAP SVZ. Esta coloração rótulos células-tronco adultas neurais, ou células B1 tipo, que têm um final apical na superfície ventricular, e como mostrado aqui, um longo GFAP + fibra basal que termina em vasos sanguíneos (setas). Vasos sanguíneos estão manchadas aqui, porque o anticorpo secundário usado para visualizar rato anti-GFAP anticorpos IgG reconhecer endógena do mouse dentro da vasculatura. Barra de escala = 50 mm.
