ヘッドオンRNAポリメラーゼによって停止した複製フォークの再起動を指示する

このメソッドは、で報告された研究で使用されポメランツとオドネル、科学327、590〜592（2010） 。 1。停止RNAPの伸長複合体のアセンブリは、以下のように行った： E.の500nMの最終濃度大腸菌の RNAポリメラーゼは、HEがバッファー100μl中T7A1プロモーター（20mMのトリス- Cl（pH7.5）中、8 mMのMgCl 2、0.5mMのEDTA、5を含むビオチン化3.6キロバイトのDNAテンプレートの5nMの最終濃度と混合された70、σ 37℃で10分のためmMのDTT、10％グリセロール） APUの100μMおよび40μMGTP、ATP、およびCTPのそれぞれが37℃でさらに10分間添加した℃、 2。ストレプトアビジンビーズ上に停止したRNAポリメラーゼの伸長複合体の固定化は、以下のように行った： ストレプトアビジン磁気コーティングされたビーズ（Invitrogen社）を200μl室温で10分間、上記の反応に加えた。 3。固定化停止RNAPの伸長複合体の精製は以下のように行った： ビーズ（上記から）、次のバッファ0.9 mLで含む、0.75MのNaCl、200μg/ mlのヘパリン、および20μg/ mlのssDNAを（上清を磁気分離することにより、各洗浄ステップの後に削除されました。）5回洗浄し、ビーズを緩衝液Aの0.9 mlで2回洗浄し、 4。 ：に正面からRNAP次のように実行された下流の相対的な複製フォークの形成ビーズ（上記から）ニューイングランドバイオラボバッファ4と樹液私の10ユニット（New England Biolabs社）100μlに再懸濁し37℃で10分間追加されました℃にビーズをバッファー0.9 mLで3回洗浄し、次にクイックT4ライゲーション反応バッファー（New England Biolabs社）を50μlに再懸濁した。クイックT4リガーゼ（New England Biolabs）2μlを室温で10分間プレアニーリングしたフォークDNAの6nmの最終濃度（RP10、RP22、RP25）と一緒に追加されました。ビーズを緩衝液Aの0.9 mlで3回洗浄し、 5。複製フォークでreplisomeとリーディング鎖合成の開始のアセンブリは、以下のように行った： DnaB 448 pmolのは（量体として）30秒のバッファを150μl（20mMのトリス- Cl（pH7.5）中、8 mMのMgCl 2、0.5mMのEDTA、5mMのDTT、10％グリセロール）でビーズとインキュベートした23℃ポリメラーゼIIIの4.9 pmolの*（はPol III HEマイナスβ）、βの15 pmolの、2mMのATP、60μMdGTP及びdATPのそれぞれを200μlの体積に添加し、37でさらに5分間℃にインキュベートした。レプリケーションは、と一緒に10μgのSSBと24μMのdATPとdTTPの各々を加えることにより開始された[α- 32 P] dTTPのと[α- 32 P] dCTPを（特定の活動、3,000〜5,000 CPM / pmol）を250の最終容量にμL。反応は、500mMのEDTA 12μLを加える時に10分後に終了した。 6。放射性標識DNA産物の精製および濃縮は次のように行った： 反応は、ビーズからDNAを除去するために終了した後、ビーズを（上から）煮沸した。ビーズに接続されている残っている残存DNAを50℃で30分間、10 ulのボリュームでプロテイナーゼKとビーズを処理することにより削除されました℃にビーズを沸騰させ、上清を磁気分離により除去した。 DNAを含む組み合わせて上清をQiagen PCRクリーンアップキットを用いて精製した。精製された放射性標識DNA産物をアルカリアガロースゲルで分析した。 ヘッドオンRNAP伸長複合体が上記のように実行された停止、しかし、σ70の存在下で*レプリケーションが省略されていました。 代表的な結果： とreplisomeの正面衝突でRNAP通常2.5 kbおよび長さは3.6 kbの二つの製品につながる。 2.5キロバイトの製品は、フォークから停止RNAPとRNAポリメラーゼとの衝突時に失速replisomeから結果へのDNAの長さを表します。 3.6キロバイトの製品は、不完全なRNAPによるプロモーターの占有または部分的replisomeヘッドオンRNAPのリードスルーのどちらかから完全長のDNAとの結果を表しています。いいや、正確な結果が約50％の完全長DNAが生成されていることを示しています。ただし、場合によっては、RNAPによるプロモーターの少ない占有が発生し、replisomesの大きい人口がヘッドオンRNAPが発生しないので、完全長のDNAの割合が高いが観察される。唯一の完全長DNA（3.6 KB）の停止RNAPの結果がない場合に複製。 図。 1 replisomeは、ヘッドオンRNAPによって妨げられている。 （A）実験のセットアップ。 E.コル私は停止伸長複合体は、前述のようにT7A1プロモーターを含むビオチン化DNA（9）にアセンブルされたRNAP。簡単に言えば、停止伸長複合体は、さらに10分間APU、GTP、ATP、およびCTPを加えて10分間、ビオチン化DNAとRNAポリメラーゼホロ酵素をインキュベートすることにより、プロモーターから20 bpsの下流に形成された。ストレプトアビジンビーズは、ビーズをバッファー0.9 mlのは、不安定なRNAP – DNA複合体と過剰のNTP削除するには、0.75MのNaCl、200 mg / mlのヘパリン、および100nMの一本鎖DNAを含むで5回それぞれ洗浄し、さらに10分間追加されました。 DNAを洗浄し、SAPIで消化し、プレアニーリングしたフォークDNAに連結した。ビーズをreplisomeの組み立て前に再度洗浄した。プロモーターは、フォークから2.5 kbの位置とフォークに向かって直接転写を指向しているさ。DnaBが追加された（B）その後replisomeがアセンブルされ、複製が存在する（レーン2）または非存在下（レーン1）のいずれかで開始されたヘッドオンRNAP。