Détection SDS-PAGE/Immunoblot de multimères de Aßi tissu cortical humain homogénats utilisant l'antigène démas
Summary
Nous décrivons une technique pour la préparation de clarifier humaine homogénats corticaux, la séparation des protéines par SDS-PAGE, la récupération d'antigène et immunoblot avec un anticorps dirigé contre le peptide Aß. En utilisant ce protocole, nous avons constamment de détecter Aßi monomère et multimère dans le tissu cortical des humains à la pathologie d'Alzheimer.
Abstract
Le pliage anormal et la polymérisation de la β-amyloïde (Aß) peptide est pensé pour initier la cascade dans la pathogenèse de maladies neurodégénératives maladie d'Alzheimer<sup> 1</sup>. Aßi est surtout un 40 – peptide d'acide ou de 42-amino qui est sujette à l'auto-agrégation en β-feuille riche en fibrilles amyloïdes qui se trouvent dans les noyaux de plaques séniles dans le cerveau La maladie d'Alzheimer. L'augmentation de preuves suggère que de faible poids moléculaire, solubles multimères Aßi sont plus toxiques que l'amyloïde Aß fibrillaire<sup> 2</sup>. L'identification et la quantification des espèces de faible poids moléculaire élevé et de Aßi multimérique dans le tissu cérébral est un objectif essentiel dans la recherche la maladie d'Alzheimer, et les méthodes employées peuvent également être appliquées à l'identification et la caractérisation des multimères toxiques dans d'autres proteopathies<sup> 3</sup>. Naturellement multimères Aßi peuvent être détectés par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS suivie par immunoblot avec des anticorps spécifiques Aßi. Cependant, la séparation et la détection de Aß multimérique nécessite l'utilisation de très concentrée homogénats corticaux et la récupération d'antigène dans les petites membranes de nitrocellulose la taille des pores. Nous décrivons ici une technique pour la préparation de clarifier humaine homogénats corticaux, la séparation des protéines par SDS-PAGE, et l'antigène de démas / blot avec des anticorps 6E10 à la région N-terminale du peptide Aß occidentaux. En utilisant ce protocole, nous avons constamment détecter les monomères Aßi, dimères, trimères, tétramères, et plus multimères de poids moléculaire dans le tissu cortical des humains à la pathologie d'Alzheimer.
Protocol
Discussion
Malgré l'importance de l'agrégation Aßi dans la pathogenèse de la maladie d'Alzheimer 1,4,5, peu d'études ont décrit ou quantifié la distribution de divers multimères Aßi dans des échantillons de tissu cortical 2. Communément utilisé des techniques d'immunohistochimie ne permettent pas la discrimination des espèces distinctes Aßi multimérique dans le tissu cortical fixe. En non fixée homogénats de tissus corticaux, multimères Aßi peuvent être séparés et év…
Acknowledgements
Un grand merci à Elaine Pranski et Carolyn Suwyn d'assistance technique excellente et à Harry LeVine III, M. Paul Murphy, et se prépare pour des conversations importantes Marla. Le financement a été fourni par RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, la Fondation Woodruff et le Comité de recherche de l'Université Emory.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Santa Cruz Biotechnology | Sc-29130 | 1 tablet in 25ml buffer | |
| BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | ||
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC1676 | ||
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Invitrogen | NP0004 | ||
| SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen | LC5925 | ||
| Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | EC6625BOX | ||
| Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size | Invitrogen | LC2000 | ||
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Will not interfere with immunostaining | |
| ATX Ponceau S Red staining solution | Sigma Aldrich | 09276 | Will not interfere with immunostaining | |
| Kapak heat sealable plastic sample pouches | Fisher Scientific | 0181225AA | ||
| 6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | ||
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931-1ML | Dilute at 1:10,000 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | ThermoFisher | 34077 | ||
| Kodak Biomax MR Film | Carestream Health | 870 1302 |
Referências
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Walker, L. C., LeVine, H. The cerebral proteopathies. Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).
- Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer’s disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
- Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers – a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
- Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).
- Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).
