Se presenta el desarrollo de un sistema automatizado de imágenes y análisis de pez cebra embriones transgénicos en placas de pocillos múltiples. Esto demuestra la capacidad de medir los efectos dependientes de la dosis de una molécula pequeña, BCI, el crecimiento de fibroblastos la expresión del gen del factor periodista y suministrar tecnología para el establecimiento de alto rendimiento de las pantallas de química de pez cebra.
Se demuestra la aplicación de la imagen basada en el contenido de alta selección (HCS) metodología para identificar pequeñas moléculas que pueden modular la vía FGF / RAS / MAPK en embriones de pez cebra. El embrión de pez cebra es un sistema ideal para las pantallas en vivo químicos de alto contenido. El embrión de 1 día es de aproximadamente 1 mm de diámetro y puede ser fácilmente dispuestos en placas de 96 pozos, un formato estándar para la detección de alto rendimiento. Durante el primer día de desarrollo, los embriones son transparentes, con la mayor parte de los órganos actuales más importantes, lo que permite la visualización de la formación de tejidos durante la embriogénesis. La automatización completa de las pantallas de química pez cebra sigue siendo un reto, sin embargo, particularmente en el desarrollo de la adquisición automática de imágenes y análisis. Anteriormente hemos generado una línea reportero transgénico que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de la actividad de FGF y ha demostrado su utilidad en las pantallas de productos químicos<sup> 1</sup>. Para establecer la metodología para las pantallas de alto rendimiento todo el organismo, hemos desarrollado un sistema automatizado de imágenes y análisis de los embriones de pez cebra a las 24-48 horas posteriores a la fecundación (HPF) en placas de 96 pozos<sup> 2</sup>. En este video podemos destacar los procedimientos para arraying embriones transgénicos en placas multipocillo en 24hpf y la adición de una molécula pequeña (BCI) que hyperactivates FGF señalización<sup> 3</sup>. Las placas se incuban durante 6 horas, seguido por la adición de tricaína para anestesiar a las larvas antes de la imagen automatizada en un Molecular Devices ImageXpress ultra láser confocal de barrido HCS lector. Las imágenes son procesadas por el software de desarrollo Definiens utilizando una red de Cognición algoritmo de la tecnología que hemos desarrollado para detectar y cuantificar la expresión de GFP en las cabezas de los embriones transgénicos. En este ejemplo podemos destacar la capacidad del algoritmo para medir efectos dosis-dependientes de BCI en la expresión del gen GFP reportero en los embriones tratados.
Un factor importante que limita el rendimiento de las pantallas de química pez cebra es la falta de una metodología sistemática para procesar placas de 96 pozos de imágenes y análisis. Como las imágenes de los organismos multicelulares complejos están contraste, baja, y de naturaleza heterogénea, los algoritmos de análisis de imagen no detectar y cuantificar estructuras específicas dentro del organismo. La mayoría de las pantallas de química publicado pez cebra por lo tanto, conlleve el examen visual de los pozos individuales por parte del personal dedicado durante todo el procedimiento. Esto por lo general evita la generación de lecturas numéricas y un completo archivo de imágenes de la pantalla y los datos. Por otra parte, la evaluación manual elimina varias ventajas claves de la imagen basada en detección, es decir, la capacidad de realizar análisis retrospectivos de rendimiento de la pantalla, para examinar los cambios fenotípicos que no eran el foco principal de la campaña de detección (por ejemplo, toxicidad o defectos en el desarrollo) y la cruz de referencia los datos del cribado con pantallas pasado o el futuro uso de la biblioteca de un mismo compuesto.
En este informe se destaca la metodología para la imagen automatizada y el análisis de embriones de pez cebra en placas de pocillos múltiples, sin intervención del usuario. Hemos automatizado de captura de imágenes en un láser confocal de barrido ultra ImageXpress lector (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a la imagen de Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 embriones en 96 placas y desarrollado un algoritmo de análisis de imagen basado en la tecnología Definiens 'Cognición de red que las buenas prácticas agrarias cuantificados expresión en las cabezas de los embriones transgénicos. El método de entrega respuestas graduadas y cuantificar la actividad in vivo de una pequeña molécula activadora de la señalización de FGF. Se obtuvieron resultados similares con la II epifluorescencia basado ArrayScan (Cellomics Inc., Pittsburgh PA) la documentación que es posible llevar a cabo la captura automática de imágenes de embriones de pez cebra en una variedad de lectores de placas disponibles en el mercado 2. El desarrollo de la metodología para analizar automáticamente las imágenes multicelulares organismo elimina la necesidad de puntuación visual por un observador humano y ha permitido la generación y archivo de los datos numéricos e imágenes para el análisis retrospectivo y comparaciones con las pantallas en el futuro.
Este trabajo está financiado por el NICHD / NIH (1R01HD053287) para Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) a Vogt, y el NHLBI / NIH (1R01HL088016) a Tsang.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Tricaine (MS222) | Sigma | Cat.# A-5040 |