액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

1. 샘플 단백질 준비 500 μl microfuge 관에서 다음을 결합 : 시약 : 추가 볼륨 * 단백질 샘플 (최대 1 MG) 최대 112 μL에 카트리지 키트에 제공된 샘플 버퍼 (5 ​​배) 30 μL DTT 1M 8μL 18 Ω H 2 O X 150μL의 샘플 볼륨의 총 μL이 ** ° C 5 분 95에서 샘플을 변성. 실내 온도 쿨. * 분리되는 단백질의 총 금액은 샘플의 복잡성에 따라 달라집니다. 이러한 조직의 homogenate 같은 좀 더 복잡한 샘플, 들어, 채널 당 150-200 μg을 권장합니다. 샘플 볼륨 미만 112 μL입니다 ** 경우, 150 μL에 최종 볼륨을 가지고 18 Ω H 2 O를 추가할 수 있습니다. 2. GELFREE 카트리지를 로딩 호일 주머니에서 GELFREE 8100 카트리지를 제거합니다. 제거하고 판 실러를 폐기하십시오. 피펫을 사용하여 카트리지 구획에서 저장 버퍼를 제거합니다. 카트리지의 모든 8 실이 사용되는 경우, 카트리지는 구획에서 저장 버퍼를 유출하는 반전 수 있습니다. 다음과 같이 카트리지 실 각 GELFREE 실행 버퍼를 추가하여 로딩을 위해 카트리지를 준비 : GELFREE 카트리지 챔버 추가 GELFREE 실행 버퍼의 볼륨 양극 버퍼 저수지 8 ML 음극 버퍼 저수지 6 ML 콜렉션 챔버스 100 μL 각 샘플 로딩 챔버로부터 버퍼를 제거하고 폐기. 8 채널 pipettor를 사용하여 로딩 챔버에 150 μL 샘플을로드합니다. GELFREE 8100 분획화 역에 로드된 카트리지를 놓습니다. 전극 배열을 낮추고 뚜껑을 닫습니다. 3. 카트리지를 실행 악기의 터치 스크린 디스플레이를 사용하여 미리 프로그램된 방법의 목록을 보려면 방법 버튼을 누르십시오. 미리 프로그램된 방법 각각의 분자 무게의 특정 범위 내에서 단백질을 해결하기위한 설정 전압 및 시간 기반 일시 중지로 구성되어 있습니다. GELFREE 8100는 방법에 지정된 간격으로 분수 수집에 대해 자동으로 일시 정지됩니다. 적절한 방법이 발견되면 검색 버튼을 누르면, 화면의 키패드를 사용하여 원하는 미리 프로그램된 방식의 번호를 입력합니다. 확인을 누르면 다음 적용 버튼을 누릅니다. 적용되고있는 방법은 메인 화면의 하단에 나타납니다. 실행에 사용됩니다 채널 (샘플 번호)를 선택하려면 주 화면에서 채널 버튼을 누르십시오. 몽땅 채널을 선택하려면 모두 선택을 누릅니다. 그런 다음, 기본 화면으로 돌아갑니다 완료 누르십시오. 안전 덮개가 닫혀 있는지 확인하고 표시등이 화면 하단에 녹색입니다. 단백질 분리를 시작하려면 시작을 누르십시오. . 그것이 분수 참고를 수집하는 시간이되면 분획화 스테이션 일시 자동 : 시스템이 실행되는 동안, 화면의 왼쪽에있는 상자에 표시된 동그라미는 각 채널의 상태를 묘사. 녹색 동그라미는 채널이 활성 상태임을 나타냅니다, 노란색 원은 악기 일시 중지했음을 나타냅니다, 그리고 빨간색 동그라미 채널이 실패했음을 나타냅니다. 적용 전압 및 전류는 채널 상태 동아리의 오른쪽에 표시됩니다. 상태 원에 노란색 설정되어 있고 텍스트 경고가 악기의 화면에 나타날 때 분수는 제거되어야합니다. 분수를 제거하려면, 악기의 뚜껑을 열고 수집 실의 각 150 μL를 철회하는 8 채널 피펫을 사용합니다. 분수가 제거되고 나면, 채널 당 100 μl를 추가하고 두 번하고 위아래로 pipetting하여 GELFREE 실행 버퍼와 함께 두 번 수집 챔버를 세척. 세척 후, 수집 실에 다시 버퍼를 실행 GELFREE의 100uL를 추가 뚜껑을 닫은 이력서 버튼을 누르십시오. GELFREE 8100은 다음 시간 간격까지 실행됩니다. 실험에 남아있는 총 시간은 화면의 오른쪽에 표시됩니다. 남은 시간 사이를 전환하려면 시간이 경과하고, 일시 정지 시간, 시간을 표시 상자 위에있는 버튼을 누르십시오. 일단 분수의 모든 공동되었습니다llected는, 그들은 즉시 isoelectric 초점이나 겔 전기 영동으로 더 하류 준비, 또는 액체 크로마 토그래피 질량 분석계 또는 면역 친 화성을 사용하여 분석을 위해 사용될 수 있습니다. 4. 대표 결과 보빈 간 homogenate의 200 μg가 GELFREE 분류 시스템을 사용하여, 12 분수 각으로 분할되었다. 각 분획 6 μL는 표준 1D SDS 페이지 젤과 실버 스테인드에서 실행되었습니다. 그림 1에 나타난 단백질 샘플 3.5kDa에서 150kDa으로 분자량 범위를 스팬, 12 독특한 분수로 fractionated되었습니다. 분자량 표준은 (ColorBurst, 시그마)도 차선 하나 14에 표시됩니다. 여기에 표시된 겔은 단백질 분류에 대한 GELFREE 8100 시스템을 사용하여 달성 높은 복구 속도를 강조 표시합니다. 여기에 표시된 젤 200 μg에서 발견한 단백질의 4 %를 나타냅니다. 그림 1. 보빈 간장에서 단백질은 GELFREE 분류 시스템을 사용하여 분리 homogenate. 각 150 μL 분수 6 μL가로드 및 1D SDS 페이지 젤과 실버 스테인드에서 실행되었습니다. 표시된으로 ​​분자량 (MW) 표준도로드되었다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.