胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化
Summary
このビデオでは、E13ラット背側脊髄から交連神経細胞を細かく分析し、文化に方法を示しています。解離交連ニューロンの軸索成長とガイダンスの細胞および分子メカニズムを研究するのに便利です。
Abstract
交連ニューロンが広く胚脊髄の開発中に軸索誘導のメカニズムを調査するために使用されている。これらのニューロンの細胞体は背側脊髄に位置しており、その軸索は、胚発生時にステレオタイプ化された軌道に従っています。交連軸索は、最初にfloorplateに向かって腹側に投影する。正中線を交差した後、これらの軸索が脳に向かって前方およびプロジェクトにします。これらの各ステップは、いくつかの指導の手がかりの作用によって調節されている。高度交連ニューロンに富んだ文化を理想的に回転アッセイ、免疫化学、生化学を含む軸索の経路探索のメカニズムを、対処する多くの実験に適しています。ここでは、E13ラット背側脊髄から交連神経細胞を細かく分析し、文化に方法を説明します。最初に、脊髄が隔離され、背板はグレー解剖されています。背側組織は、トリプシン処理し、機械的破砕により細胞懸濁液にして解離している。神経細胞はポリ- L -リジンでコーティングされたガラス製カバースリップまたは組織培養皿に播種されています。 30時間後<em> in vitroで</em>、ほとんどのニューロンは軸索を拡張している。文化の純度（ヤム<em>ら。</em> 2009）、通常は90％以上、交連ニューロンのマーカーDCC、LH2とTAG1（ヘルムズとジョンソン、1998）で免疫標識によって評価することができる。この神経細胞の準備はするのに便利なツールです。<em> in vitroで</em>脊髄の開発時の交連軸索成長とガイダンスの細胞および分子メカニズムの研究。
Protocol
Discussion
我々は、ラット胚脊髄から交連神経細胞を細かく分析し、文化に方法を記載している。この手順は、定期的に確実に軸索ガイダンスの細胞および分子メカニズムを研究する神経細胞を準備する私たちのラボで使用されています。細胞生物学および免疫化学実験、一腹の子の解剖のために十分なニューロンを生成します。より多くの細胞がこのような多くの生化学の実験のように、必要な場合?…
Acknowledgements
この作品は、カナダ衛生研究所（CIHR）、ピーターライード医学研究財団、Neuroengineeringのマギルプログラムからの補助金によって支えられて、フォンデルシェルシュエンサンテケベック（FRSQ）、およびイノベーションのためのカナダ基金（CFI ）。セバスチャンD.ラングロワはデラルシェルシュエンサンテケベック（FRSQ）と健康研究（CIHR）のカナダの協会からフレデリックバンティングとチャールズベストカナダ大学院奨学金で修士賞フォンからマスターのトレーニング賞によってサポートされていました。我々は数字の支援のためのジェシカMTファムに感謝しています。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium, liquid | Invitrogen | 21103-049 | See Recipes and Comments | |
| B27 supplement 50X | Invitrogen | 17504 | See Recipes and Comments | |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma | P4707 | ||
| L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-070 | ||
| Trypsin 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090-046 | ||
| DNAse I, 25000 U/mL | Worthington | |||
| MgSO4 | Sigma | M2643 | ||
| HBSS, Ca2+/Mg2+-free | Invitrogen | 14170-112 | ||
| L-glutamine 200mM, liquid | Invitrogen | 25030-081 | See Recipes and Comments |
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I)
- E13 pregnancy-staged rat
- Ethanol 70%
- Surgical scissors, Fine Science Tools
- Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools
- Petri dishes
- L-15 medium
- Dissection microscope, Leica
- Plastic transfer pipettes
- Microscissors, Fine Science Tools
- Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools
- Heat-inactivated Horse Serum (HiHS)
- 15 ml plastic tubes
Commissural neuron culture (see also Table I)
- Tissue culture incubators (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
- German Desag glass coverslips and/or plastic tissue culture dishes
- Poly-L-lysine, Sigma
- Sterile milliQ H2O
- Neurobasal, Invitrogen
- Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HiFBS)
- L-Glutamine
- B27, Invitrogen
- Penicillin/Streptomycin antibiotics
- 37°C waterbath
- Sterile Pasteur Pipettes
- Bunsen gas burner
- HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen
- DNAse, Worthington
- MgSO4
- Centrifuge
- Hemacytometer
- Trypan Blue Solution
Referências
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc. Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).
- Helms, A. W., Johnson, J. E. Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression. Development. 125, 919-928 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
- Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons. Nature. 444, 369-373 (2006).
- Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway. Neuron. 62, 349-362 (2009).
