Het belang van correcte eiwitconcentratie voor Kinetics en affiniteit Bepaling in structuur-functie analyse

Figuur 1. De drie-dimensionale structuur van de cystatine B-complex (blauw) met papaïne (geel). Gemuteerde cystatine B-residuen zijn in rood weergegeven. 1. Principes van Label-vrije interactie analyse met behulp van Biacore Systems In een typisch label-free binding experiment met behulp van een Biacore-systeem, een biomolecule aangeduid als de 'ligand' wordt gehecht aan het oppervlak van een sensor chip. Een systeem van stroom-kanalen brengt zijn bindende partner, de zogenoemde 'analyt', in contact met de chip oppervlak, waar de detectie plaatsvindt. Wanneer de analyt bindt aan de ligand, is de resulterende wijzigingen in de massa ophopen aan het oppervlak gedetecteerd door surface plasmon resonance (SPR). Het SPR reactie is evenredig aan de hoeveelheid van bindende analyt. Omdat de binding wordt gemeten in real time, kan de kinetische associatie en dissociatie snelheidsconstanten voor een specifieke interactie worden bepaald. Uit deze constanten, is het mogelijk om de affiniteit te berekenen als het evenwicht dissociatieconstante. Het is ook mogelijk om affiniteit berekenen op basis van steady-state binding gegevens. Een soortgelijke methodologie kan ook worden gebruikt om de concentratie van een eiwit dat specifiek aan een ligand bindt aan de oppervlakte te bepalen. 2. Het analyseren van kinetische eigenschappen van een eiwit-eiwit interacties In Biacore X100, kan kinetische analyse worden uitgevoerd met behulp van single-cycle kinetiek. In een single-cycle kinetiek experiment, is een concentratie serie van de analyt geïnjecteerd in een enkele analyse cyclus zonder regeneratie van de oppervlakte in tussen de injecties. Daarom, single-cycle kinetiek maakt kinetische analyse als het moeilijk is te vinden geschikte regeneratie condities. Zodra de gegevens voor een kinetische experiment zijn verzameld, Biacore X100 evaluatie software genereert de waarden van k een, k d en K D door het aanbrengen van de gegevens naar een interactie model. 3. Benaderingen bepalen eiwitconcentratie Het analyseren van de interacties tussen biomoleculen is belangrijk voor het begrijpen van hun functie. Kenmerkend zijn voor de binding van eiwitten aan andere eiwitten, aan nucleïnezuur, of om kleine moleculen is fundamenteel voor biochemisch onderzoek, en vindt het gebruik in veel andere gebieden, waaronder drug discovery. Voor nauwkeurige metingen van de interactie kinetiek tussen twee interagerende eiwitten is het essentieel om de concentratie van specifiek bindend eiwit weten in de experimentele monster dat wordt gebruikt als analyt. Een spectrofotometer lezen van een 280 of colorimetrische assays, zoals het een dienst Bradford-reagens wordt vaak gebruikt om de totale eiwitconcentratie te bepalen. Echter, eiwit onzuiverheden invloed op het resultaat. Wat nog belangrijker is, zijn zowel actieve als inactieve vormen van het eiwit in de totale hoeveelheid eiwit concentratie. Vooral in het geval van recombinante eiwitten, die kunnen worden inactief door onjuiste vouwen, is het belangrijk om te bepalen percentage van specifiek bindend eiwit in het monster. In Biacore X100, kan de concentratie gerelateerd aan specifieke bindende activiteit worden bepaald door vergelijking van de binding respons op een ijkcurve afgeleid van een bekende standaard, of door gebruik te maken van de meer recent geïntroduceerde methodiek Calibration-vrije concentratie Analyse (CBVC). CFCA vertrouwt niet op een standaard. Daarom CFCA is vooral nuttig in het geval van het bestuderen van mutante vormen van eiwitten, waar de normen zijn meestal niet beschikbaar. In een CFCA experiment, is de initiële binding snelheid gemeten bij verschillende debieten onder voorwaarden bij de diffusie van monster op de chip oppervlak is snelheidsbepalend. De diffusiecoëfficiënt van de analyt, zijn de afmetingen van de stroom cel en het debiet rekening gehouden bij de berekening van de specifieke binding concentratie van de initiële binding tarief 1,2. In een kinetiek experiment, is de concentratie van de analyt gebruikt bij de berekening van de kinetische vereniging constant en de affiniteit van de experimentele data. CFCA en kinetische meting in Biacore systemen zowel rekenen op dezelfde interactie eigenschappen. Daarom is het gebruik van de specifieke binding concentratie wordt bepaald door Biacore-analyse, in plaats van totaal eiwit concentratie, verhoogt de betrouwbaarheid van de resultaten. 4. Met behulp van Biacore analyse om de interactie tussen cystatine B en Papaïne karakteriseren Zoogdieren cystatine B is een reversibele, competitieve en strak-bindend eiwit remmer van papaïne-achtige cysteïne proteasen, voornamelijk cathepsine B, H, K, L en S. Deze eiwitten zijn vooral betrokken bij de nonnenelectieve intracellulaire eiwitafbraak. Cystatins worden geacht aan cellen en weefsels van ongepaste proteolyse te beschermen door deze enzymen. Ze hebben ook inactiveren cysteine ​​proteasen van parasieten en virussen en kunnen deelnemen aan de verdediging tegen invasie van deze infectieuze agentia. Daarnaast, cystatins remmen verscheidene plantenziekten cysteïne proteasen, zoals papaïne, die vaak wordt gebruikt als een model enzym in structuur-functie studies. De drie-dimensionale structuur van de cystatine B-complex met papaïne 3 laat zien dat de interactie tussen de twee eiwitten wordt gedomineerd door hydrofobe contacten, die vanaf de kant-remmer, worden door de N-en C-terminale uiteinden en twee hairpin loops ( figuur 1). In deze studie onderzoeken we het belang van de C-terminale uiteinde en de tweede bindende lus van cystatine B voor binding aan papaïne door gebruik te maken van runderen cystatine B-varianten met puntmutaties in gebieden van interactie met papaïne. We eerst bepalen de specifieke binding concentratie van de vier cystatine gebruikte B-varianten, evenals die van de wild-type eiwit. Zodra de specifieke binding concentraties van de actieve cystatine B worden bepaald, zijn de snelheid en de affiniteit constanten van wild type en mutante varianten van cystatine B binding aan papaïne gemeten met behulp van Biacore X100. 5. Instrument en reagentia De cystatine B varianten Cys3Ser/His75Gly, Cys3Ser/Leu73Gly, zijn Cys3Ser/Tyr97Ala en Cys3Ser zoals eerder beschreven 4 geproduceerd. Alle mutanten bevatten een extra substitutie van cysteine ​​naar serine op positie drie, tot de vorming van disulfide-linked inactieve dimeren van cystatine B. te voorkomen De papaïne doel is ook bereid zoals eerder beschreven 5. Het is S-(methylthio) papaïne (MMT-papaïne) met een methylthio groep aan Cys25 in de actieve spleet, waardoor de protease katalytisch inactief. Biacore X100 met Biacore X100 Plus Pakket wordt gebruikt voor het meten en analyseren van de specifieke binding concentraties en bindingskinetiek. MMT-papaïne is geïmmobiliseerd op de sensor chip CM5 met behulp van Biacore Amine Koppeling Kit. De pistes worden uitgevoerd bij 25 ° C, en de buffer is 0,01 M Hepes bij pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,0034 M EDTA en 0,05% polysorbaat 20. Tussen elke variant van cystatine B, is de sensor oppervlak geregenereerd met 20 mM NaOH gedurende 30 seconden bij een debiet van 10 pl / min. 6.Immobilization van de MMT's Ligand-papaïne Covalente binding van MMT-papaïne voor CFCA analyse CFCA is gebaseerd op het meten van bindende tarief onder omstandigheden waarbij het tarief wordt beperkt door diffusie van analyt moleculen aan het oppervlak (massatransport beperking). Dit wordt bevorderd door een hoge mate van immobilisatie van de ligand. Immobilisatie van MMT-papaïne werd opgezet en uitgevoerd met de immobilisatie tovenaar van Biacore X100 Control software. Activeer de oppervlakte in flow cel 2 door injectie van een mengsel van succinimide (NHS) en carbodiimide (EDC) voor de 7 minuten bij een debiet van 10 pl / min. Flow cel 1 blijft ongewijzigd om te worden gebruikt als referentie oppervlak. Injecteren MMT-papaïne op 50μg/ml in natriumacetaat buffer bij pH 4,5 gedurende 15 minuten bij een debiet van 5 pl / min. Ethanolamine wordt geïnjecteerd 7 minuten bij een debiet van 10 pl / min om de resterende actieve esters uit te schakelen. De gehele koppeling procedure moet leiden tot ~ 3000 RU MMT-papaïne geïmmobiliseerd in flow cel 2. Covalente binding van MMT-papaïne voor kinetische analyse Dezelfde procedure wordt gebruikt voor het immobiliseren MMT-papaïne voor kinetische analyse, met als enige verschil dat in de kinetische analyse, de immobilisatie niveau moet worden laag in om het bindend tarief wordt beperkt door diffusie te voorkomen. Flow cel 1 blijft ongewijzigd in deze stap zo goed in om te worden gebruikt als een referentie-oppervlak. Na het activeren van het oppervlak met het mengsel van NHS en EDC als in 7.1, is het MMT-papaïne geïnjecteerd op 1μg/ml voor 50 seconden. Daarna is het oppervlak is gedeactiveerd met een injectie van ethanolamine zoals in stap 7.3. De koppeling niveau moet ongeveer 50 RU na deze procedure. 7. Het bepalen van cystatine B concentratie met behulp van het CBVC assay Het CBVC experiment is opgezet volgens het CBVC tovenaar in Biacore X100 Plus Pakket. Ongeveer 10 nM eiwit wordt ingespoten bij een flow 10 en 100 ul / min in tweevoud voor 48 seconden. Het oppervlak wordt geregenereerd met 20 mM NaOH tussen elke cyclus. Onder meer blanco injecties voor elk debiet. De eiwitconcentratie wordt vervolgens bepaald door de binding data (Figuur 3) met behulp van ee CBVC evaluatie kenmerk van Biacore X100 Plus Pakket evaluatie software. Figuur 2. Resultaten van het CBVC analyse van de wild-type cystatine B. De specifieke binding concentratie gegevens uit de sensorgrams verkregen bij debieten van 10 en 100 ul / min. Figuur 3. Concentraties van de mutanten bepaald met behulp van een 280-meting (n = 3) en CBVC (n = 2). De standaard fouten zijn aangegeven met foutbalken. De molaire absorptie coëfficiënten werden berekend zoals beschreven in (6). Een groot verschil in de concentraties van Cys3Ser/Leu73Gly mutant bepaald door de twee methoden kunnen worden waargenomen. Bij het ​​vergelijken van de concentratie bepaald door een meting met 280 dat door het CBVC, is het duidelijk dat, terwijl in de meeste gevallen het eiwit is volledig actief, voor de Cys3Ser/Leu73Gly variant, de fractie van de actieve eiwitten is zeer laag (Figuur 3). De onderstaande tabel geeft de activiteiten van cystatine B varianten met betrekking tot de totale concentraties van A 280. Monster CFCA in relatie tot A 280 (%) Wild-type 94 Cys3Ser/His75Gly 101 Cys3Ser/Leu73Gly 9 Cys3Ser/Tyr97Ala 99 Cys3Ser 83 8. Het meten van de Kinetiek van cystatine B binding aan Papaïne Op basis van de CBVC metingen, voor te bereiden een twee-voudige concentratie series variërend van 2,5 tot 40 nm voor elk van de cystatine B-varianten. De kinetiek experiment is opgezet met behulp van de kinetiek wizard in Biacore X100 met de single cycle benadering. Het oppervlak is niet geregenereerd tussen de injecties, maar na het einde van elke analyse waarbij gebruik wordt gemaakt van 20 mM NaOH als regeneratie-oplossing. Stel het experiment, zodat elke cyclus bevat monster wordt geflankeerd door een lege cyclus, waar de buffer wordt ingespoten in plaats van het monster. Gebruik de kinetiek evaluatie-functie in Biacore X100 om automatisch uit te voeren blanco aftrekkingen van referentie afgetrokken gegevens voordat het monteren van een 1:01 interactie model. De experimentele gegevens voor de binding van cystatine B varianten papaïne is weergegeven in figuur 4. De onderstaande tabel een overzicht van de associatie en dissociatie snelheidsconstanten en het evenwicht dissociatieconstanten verkregen in de kinetische analyse. Monster k een (M -1 s -1) k d (s -1) K D (M) Wild-type 1,8 x 10 6 0,41 x 10 -3 2,3 x 10 -10 Cys3Ser/His75Gly 1,1 x 10 6 1,7 x 10 -3 1,5 x 10 -9 Cys3Ser/Leu73Gly 1,1 x 10 6 23 x 10 -3 2,2 x 10 -8 Cys3Ser/Tyr97Ala 1,7 x 10 6 12 x 10 -3 7,1 x 10 -9 Cys3Ser 0,9 x 10 6 0,53 x 10 -3 5,8 x 10 -10 Figuur 4. Kinetic profielen voor cystatine B varianten binding aan MMT-papaïne bepaald met behulp van enkele cyclus kinetiek. Sensorgrams tonen blanco-en referentie afgetrokken gegevens met kinetische geschikt voor 01:01 interactie model overlay in het zwart. Hoewel de vereniging tarieven van de mutanten zijn vergelijkbaar met die van de wild-type eiwit (Figuur 5, bovenste paneel), kan de dissociatiesnelheid constanten van de mutanten hoger met bijna twee ordes van grootte, met een overeenkomstige stijging van het evenwicht dissociatie constant (Figuur 5, onderste paneel). Figuur 5. De berekeningen van de snelheid en de affiniteit constanten waren gebaseerd op de concentraties verkregen uit CBVC. De veranderingen van k een, k D en K D, in verband met de mutaties zijn weergegeven in de grafieken. Aangezien de gemeten concentratie is een parameter in de berekening van de vereniging snelheidsconstante uit de experimentele gegevens, is hetbelangrijk dat deze correct is. Met behulp van de concentratie op basis van de A-280 meting in plaats van CBVC zou leiden tot de conclusie dat Leu73 van belang is voor de vereniging tarief, wanneer de vervanging lijkt te resulteren in ongeveer 10 keer trager dan de andere vereniging cystatine B-varianten. Echter, de specifieke binding concentratie gemeten door CBVC is slechts ongeveer 10% van de totale hoeveelheid eiwit in dit geval. Wanneer dit wordt daarmee rekening gehouden wordt duidelijk dat de vereniging tarief voor Leu73 is gelijk aan die van de andere varianten. Daarom CFCA zorgt voor juiste beoordeling van een k en K D waardoor mogelijk de juiste interpretatie van de interactie mechanisme.