Robotik und Dynamic Image Analysis für Studies of Gene Expression in pflanzlichen Geweben

Die folgende Methode beschreibt ein Protokoll für die Bildanalyse der Genexpression mit Hilfe eines automatisierten Bild Sammelsystem. Zur Vereinfachung der Erläuterung wurde der gesamte Ansatz in vier Schritte unterteilt: 1) Samen Vorbereitung, 2)-Gen Einführung mit Partikelbeschuss 3) Roboter-Bild-Sammlung, und 4) Bildanalyse. Obwohl diese allgemeine Methode für eine breite Palette von anderen Anwendungen verwendet werden können, sind die vorliegenden Sätze von Protokollen über den Einsatz des grün fluoreszierenden Proteins (GFP)-Gen, das eine nützliche Reportergen für die Verfolgung von Genexpression in dem gleichen Stück basiert von lebendem Gewebe im Laufe der Zeit. I. Saataufbereitung Lima Bohne (. Phaseolus lunatus cv Henderson-Bush) Samen können gekauft werden, oder idealerweise von Pflanzen in einer Klimakammer gewachsen (50% relative Luftfeuchtigkeit, 16 / 8 h Licht: Dunkel, 25/23 ° C Tag / Nacht) geerntet. Nach der Ernte Samenqualität kann durch Speicherung Samen bei -20 ° C gehalten werden Bereiten Magenta GA7 Behälter für keimenden Samen. Falten Filterpapier oder Papiertüchern in der Unterseite des Magenta-Boxen fit. Add ~ 25 ml destilliertem Wasser auf jeden Container auf Küchenpapier anfeuchten und abgießen absorbierte Wasser. Autoclave angefeuchteten Papier-haltigen Boxen für 20 min. Mit 50 ml Einweg-Röhrchen, sterilisieren Samen in eine 10% ige handelsübliche Bleiche-Lösung (20 Samen in 20-40 ml) für 20 min unter Schütteln auf einem Kreiselschüttler bei 60 Umdrehungen pro Minute. Hinweis: Alle nachfolgenden Schritte sollten in einer Sterilbank durchgeführt werden. Spülen Samen 4-7 mal mit sterilem, deionisiertem Wasser unter leichtem Rühren für 30 sec bei jeder Spülung. Legen Sie 5-6 sterile Samen zwischen den Schichten des gefalteten Papiers in jedem sterile Magenta-Box befindet. Inkubieren Samen für 4 Tage unter den folgenden Bedingungen: 25 ° C, 16 / 8 h Licht: Dunkel und 40 μEm -2 s -1. II. Gene Einführung mit Partikelbeschuss Build-Gen-Konstrukte mit Ihrem Lieblings-Expressionsvektor mit einem Reporter-Gen, das in lebenden Geweben überwacht werden kann. Wir haben technisch hoher Kopienzahl Expressionsvektor nützlich für Veranstalter und Promoter-Elemente-Analysen. Dieser Vektor enthält das GFP-Gen, mit dem Promotor / Promotor-Element-Funktion in transformierten Gewebe sichtbar ist. Rund 1-2 h vor dem Bombardement, Verbrauchsteuern Limabohne Keimblätter aus Keimlingen und entfernen Sie die Samenschalen. Keimblätter für Bombardements sollte gelb bis hellgrün, flach und frei von Schäden, die mit weiteren Bildanalyse stören könnten. Legen Sie Keimblätter auf OMS Kulturmedium mit MS-Salze 1, B5 Vitaminen 2, 3% Saccharose und 0,2% Gelrite (pH 5,7) unmittelbar nach dem herausgeschnitten. Fällung der DNA auf M10 Wolfram-Teilchen (Sylvania, Towanda, PA, USA) zu konstruieren. In einem 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 25 ul Wolfram-Teilchen (Partikel werden in sterilem Wasser, 100 mg ml -1 resuspendiert, direkt vor Gebrauch), 5 ul DNA (1 ug ul -1), 25 ul 2,5 M Calciumchlorid (Sigma -Aldrich Cat. C3881-500G) und 10 ul 100 mM Spermidin (Sigma Cat. S-2626). Vortex kurz mischen alle Komponenten. Inkubieren Sie die DNA-Präparation auf Eis für 5 min. Dann entfernen und entsorgen 50 ul Überstand. Die DNA-beschichteten Partikeln durch Vortexen und sofort entfernen 2 ul Aliquot. Wiederholen Sie diesen Schritt Vortexen jedes Mal ein Aliquot aus dem Rohr entfernt ist. Beschichtete Partikel sollten in Eis aufbewahrt werden und innerhalb von 15 min. Durch die Spitze einer Spritze Filter, Platz 2 ul beschichteten Partikel in der Mitte des Filters Bildschirm. Setzen Sie die Filter-Einheit mit der beschichteten Partikel im Filter Aufnahmeeinheit in der particle gun Kammer. Legen Sie eine Limabohne cotyledon oberseits bis auf eine Schallwand und Ort der Schallwand in der particle gun Kammer. Die Schallwand, die aus einem Bildschirm geschmolzen, um den Boden eines Bechers besteht, wird als Plattform für die Gewebe während der Bombardierung Unterstützung verwendet wird. Bombard das Gewebe mit Hilfe eines Particle Gun (in dieser Methodik, verwenden wir eine einfache und kostengünstige Particle Gun Zulauf 3, PIG, in unserem Labor entwickelt) wie folgt: a) Öffnen des Ventils führen, um das Vakuum an die Kammer zu evakuieren, b) nach das Vakuum erreicht 760 mm (30 Zoll) Hg, aktivieren Sie das Magnetventil und Freigabe des Heliums, die Partikel treiben, c) nach Partikelbeschuss, schließen Sie die Saugleitungsventil und das Vakuum mit dem Auslassventil. Die Helium-Druck verwendet werden, um Teilchen zu beschleunigen ist 50 PSI. Nachdem das Vakuum freigesetzt wird, öffnen die Tür der Kammer, die bombardiert Keimblätter abrufen und zurückgeben cotyledon, oberseits bis zu OMS Kulturmedium. Hinweis: Für die Quantifizierung und Expression Profiling, wir in der Regel bombardieren ein Minimum von drei Keimblätter für jede DNA-Konstrukt. Eine positive Kontrolle, die in der Regel ist ein DNA-Konstrukt, das gibt ein gut untersuchtes Genexpressionsprofil, wird als Referenz enthalten. III. Automated Image Collection Schalten Sie die Quecksilberlampe und warten Sie 30 min für die Lampe, um sich aufzuwärmen. Schalten Sie die Stromquelle für den Spot-RT-CCD-Kamera (Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI, USA) und der Robotik-Plattform Motorsteuerung, die die Bewegung der Robotik-Plattform treibt. Setzen Sie die Filter-Set für GFP-Detektion (GFP2 Filter gesetzt;.. Ex 480/40 nm, EM 510 LP) auf einem MZFLIII Präpariermikroskop (Leica, Heerbrugg, Schweiz). Sterilisieren der verdickten Polycarbonat Petrischale Deckel durch Besprühen mit 70% Ethanol. Die spezielle Deckel, der zur Abdeckung der Petrischale Basis verhindern Kondensation während image Kollektion 4. Legen Sie die Platten mit bombardiert Keimblätter auf der Robotik-Plattform (Arrick Robotics, Hurst, TX, USA) der automatisierten Bild Sammelsystem. Die Robotik-Plattform wird durch einen Schrittmotor angetrieben und setzen besteht aus einem Tisch zur Befestigung von 8 Petrischalen. Die Plattform besteht aus Polycarbonat, Polypropylen und Aluminium. Die Platten werden in Position durch Anziehen einer seitlichen Kunststoff-Madenschraube befestigt. Öffnen Sie die benutzerdefinierte Software-Anwendung, die sowohl die Robotik-Plattform und die Bildaufnahme steuert. Auch, öffnen Sie die Software weißes Licht Controller wechseln. In der "Motor motion" Registerkarte auf "Motor" und "Wohnmobil" klicken. Nachdem die Software richtet die Plattform, um die Home-Position, sind wir bereit, um den Anfang Positionen für jedes Keimblatt. In der "Motor motion", wählen Sie die erste Platte. Die Plattform wird die Mitte der Petrischale unter dem Objektiv des Mikroskops Position. Mit dem beweglichen Abstand Tasten, exakt zu positionieren das erste Keimblatt für Bild-Sammlung. Mit dem weißen Licht-Controller auf, kann die Zielregion durch den Computer-Monitor, indem Sie auf den "Live-Modus"-Funktion beobachtet werden. Für das erste Keimblatt, den Fokus und Vergrößerung (1,6 fach Vergrößerung ist bevorzugt) mit der manuellen Regler auf der Präpariermikroskop. Fokus Anpassungen für die übrigen Keimblätter auf der gleichen Platte gemacht mit drei Stellschrauben unter jeder Platte, auf der Robotik-Plattform. Nachdem die Region von Interesse eingestellt wurde, klicken Sie auf den "add dieser Position"-Knopf. Die Software wird die Koordinaten dieser Region um eine Position Zeitplan-Datei hinzufügen und die Plattform wird in die Mitte der Platte zurück. Stellen Sie die Positionen und Schwerpunkte für alle übrigen Keimblätter auf Tellern mit den beweglichen Abstand Tasten und manuelle Stellschrauben. Nach all den Koordinaten aller Keimblätter eingegeben worden sind, speichern Sie die Position Zeitplan koordiniert. Geben Sie die Bildsammlung Parameter. In der "Bild-Einstellung", wählen Sie die Art des Lichts gewünscht, weiß oder blau. Für GFP-Erkennung, sollte nur das blaue Licht verwendet werden. Geben Sie außerdem die Einstellung der Belichtung. Obwohl wir die Zeit der Exposition für Rot, Blau und Grün Farbe ändern können, verwenden wir meist die gleichen Einstellungen für GFP Fotodokumentation (20, 14 und 14 Sek. für Rot, Grün und Blau-Kanäle bezeichnet) ermöglicht uns, um direkte und konsistente Vergleiche zwischen verschiedenen DNA-Konstrukte. In die gleiche "Bild-Einstellung" Registerkarte, geben Sie einen leeren Ordner, in dem die Bilder gespeichert werden. Jede Serie von Bildern wird in diesem Master-Ordner in unabhängigen Ordnern gespeichert werden, fortlaufend nummeriert nach der Reihenfolge der Positionen für Keimblätter eingetragen. Gehen Sie auf die "capture time control"-Registerkarte und stellen die Bildaufnahme Zeitintervall und Anzahl der Zyklen der Bildsammlung. Die Bilder werden in der Regel jede Stunde für 100 h gesammelt und erzeugt wohldefinierte Genexpressionsprofile. Starten der Bildaufnahme, indem Sie auf den "run Zeitplan!" Schaltfläche in der "Position Zeitplan" Registerkarte befindet. Am Ende der 100 h Bild Sammlung, Übertragung aller Bilder aus dem Computer die Steuerung der Roboter keine große Kapazität der Festplatte oder Computer zur weiteren Analyse der Bilder. Hochauflösende Bilder (1600 x 1200 Pixel) werden als TIF-Dateien Mess ~ 5 Mb jedes gesammelt. IV. Image Analysis Montieren Sie die 100 aufeinander folgenden Bildern aus den einzelnen Ordnern mit Adobe ImageReady. Öffnen Sie ImageReady und importieren alle aufeinander folgenden Bildern komponierte eine Reihe als Rahmen. Resize Originalbilder zu 800 x 600 Pixel. Gesammelte Bilder mit hoher Auflösung, die große Dateien, die machen Bildverarbeitung verlangsamen können generiert. Blättern Sie durch die Bilder und finden Sie einen Ort (e) sichtbar in den meisten Bildern. Zoom bis zu 300% von der gewählten Stelle (n). Ausrichten von Bildern mit höherer Vergrößerung erlaubt eine präzise Erfassung. Legen Sie eine Schicht auf alle Bilder und stellen Sie sicher, sichtbar in allen Frames. Markieren Sie die Stelle (n) Lage mit dem "Pinsel"-Werkzeug. Beginn der Angleichung aller Bilder mit dem "move"-Tool und unter den Marken auf der Ebene als Referenz. Wenn die Ausrichtung abgeschlossen ist, löschen Sie die Ebene als Referenz verwendet und Speichern von Bildern als ein einziges "psd"-Datei. Auch Export aller Bilder als ein einziges "mov"-Datei mit der höchsten Auflösung. Manuelle Ausrichtung der einzelnen Bildserien nimmt ~ 10 min. Führen Sie die Quantifizierung der Genexpression mittels ImageJ. Öffnen ImageJ-Software und öffnen Sie die "mov"-Datei gespeichert zuvor in ImageReady. Mit dem Auswahl-Werkzeug, wählen Sie eine 400 x 300 Pixel großen Bereich und das Bild zuschneiden. Diese neue Datei sollte als "avi"-Datei gespeichert werden. Trennen Sie die aufeinander folgenden Bildern, in der neuen "avi"-Datei in rot, blau und grün-Kanäle, indem Sie "Bild", "Farbe" und "RGB split" in ImageJ entfernt. Subtrahieren Sie die Hintergrund-Fluoreszenz von allen Bildern in der grünen und roten Kanälen. Mit den grünen Kanal Bildserien, wählen Sie eine 20 x 20 Pixel großen Bereich aus einer Region mit nicht-exprimierenden Zellen und notieren Sie seine Position in der "ROI-Manager"-Tool, so dass die gleiche Fläche in beide Kanäle ausgewählt werden. Mit der 20 x 20 Pixel-Quadrat aktiv in den grünen Kanal, den "plugins"-Befehl in der Task-Leiste von ImageJ befindet gehen und dann klicken Sie auf den "subtrahieren gemessen ROI für jede Scheibe" Plugin-Tool. In ImageJ, auf "Image" klicken, "Anpassen" und dann "Schwelle" zu definieren, oder ein Segment der GFP-exprimierenden Pixel. Passen Sie die Schwellenwerte, indem Sie die Leiste in die Schwelle Fenster auf eine durchschnittliche Spot-Größe von 20-30 Pixel zu erhalten. Bestimmen Sie die GFP-Expression mit einem Plugin, das wir messen die mittlere Grauwert pro Pixel und die Gesamtzahl der GFP-exprimierenden Pixel konzipiert. Kopieren Sie die mittlere Leistung Grauwerte in ImageJ und Einfügen in Microsoft Office Excel. Berechnen Sie die GFP-Expression für jeden Kanal (rot und grün) durch Multiplikation der mittleren Grauwert pro Pixel durch die Gesamtzahl der GFP-exprimierenden Pixel für jeden Kanal. Die Summe des Ausdrucks Werte für beide Kanäle gibt die GFP-Expression. Die Werte können verwendet werden, um Genexpressionsprofile veranschaulichen und direkte Vergleiche werden. Zeitraffer-Animationen können auch generiert werden mittels "mov" oder "avi"-Dateien und bietet eine einzigartige und klare Darstellung der Genexpression Profil. V. repräsentative Ergebnisse Die Roboter-Bild Sammlung und Analyse-Verfahren (Abb. 1) berichtet, hier kann der Erwerb einer großen Menge von quantitativen Daten auf die Genexpression in kurzer Zeit. Für pflanzlichen Promotor Charakterisierung mit dem GFP-Gen, ist diese Methode nicht nur nützlich, um transiente Expression Profile zu erstellen (Abb. 2), sondern auch in einer detaillierten Weise-GFP-Expression in transient-und stabil transformierten Pflanzengewebe 5,6 Spur. Kurze Zeitraffer-Animationen mit den gesammelten sequentielle Bilder erzeugt werden ein wertvolles Werkzeug für die eingehende Analyse der Genexpression im Laufe der Zeit in pflanzlichen Geweben. Diese Methode hat auch große Anwendung auf Faktoren, die direkten Einfluss auf die Genexpression zu evaluieren. Zum Beispiel hat transiente GFP-Expression unter der Anwesenheit verschiedener Suppressoren zum Schweigen zu viralen Ursprungs erfolgreich studiert mit unseren automatisierten Bild Sammlung und Analyse-System 7,8. Abbildung 1. Bildanalyse Verfahren besteht aus vier wesentlichen Schritten. (A) Aufnahme von Bildserien mit der Roboter-Bild Sammelsystem, (B) Trennung der Bilder in Rot, Blau und Grün-Kanäle, (C) Segmentierung der Ausdruck Pixel durch Anpassung der Schwellenwerte, und (D) erhalten die Ausgabe Ergebnisse mit den Grauwerten und die GFP-exprimierenden Fokus Zählen. Abbildung 2. Graph zeigt verschiedene transiente Expression Profile pflanzliche Promotoren fusioniert an GFP angetrieben. Die Daten wurden gesammelt, mit unserem Roboter-Bild-Sammlung und Analyse mit ImageReady und ImageJ Software.