نحن تقرير طريقة لإدخال وتعقب والتحليل الكمي التعبير GFP في الخلايا النباتية. هذه الطريقة تستخدم نظام التشغيل الالي للمصمم خصيصا لجمع صورة شبه مستمرة من أعداد كبيرة من العينات ، وعلى مر الزمن. نظهر أيضا استخدام ImageJ وImageReady لتحليل سلسلة الصور.
عادة ما يتم دراسة التعبير الجيني في أنسجة النبات عن طريق الاستخلاص المدمرة للمركبات من الأنسجة النباتية ل<em> في المختبر</em> التحليلات. قدمت وسائل الاستفادة من هنا البروتين الفلوري الأخضر (<em> GFP</em>) لرصد الجينات مستمر في التعبير الجيني في نفس قطعة من الأنسجة ، وعلى مر الزمن. و<em> GFP</emوضعت> الجينات تحت السيطرة التنظيمية المختلفة والمروجين أدخلت الأنسجة ليما الفول cotyledonary عبر القصف الجسيمات. ثم وضعت النبتات على نظام جمع الصور الروبوتية ، الذي تألف من تشريح مضان المجهر مع الكاميرا الرقمية ومنصة الروبوتات 2 الابعاد مصمم خصيصا للسماح للمرفق آمن من الأطباق الثقافة. وقد تم جمع الصور من الأنسجة cotyledonary كل ساعة لمدة 100 ساعة لتوليد ملامح التعبير عن كل المروج. تعرض السلسلة الأولى من كل الصور التي تم جمعها من 100 إلى محاذاة الصورة اليدوي باستخدام ImageReady للتأكد من أن GFP – معربا عن بؤر تم الإبقاء على الدوام داخل حقول مختارة من التحليل. ثم تم اختيار مناطق معينة من سلسلة قياس 300 × 400 بكسل ، لمزيد من التحليل لتوفير قياسات كثافة GFP ImageJ باستخدام البرمجيات. تم فصل الصور دفعة في القنوات الأحمر والأخضر والأزرق والتي تعرب عن GFP. مجالات تم تحديدها باستخدام ميزة عتبة ImageJ بعد طرح مضان الخلفية (الطرح القيم الرمادية غير التعبير عن كل بكسل من بكسل) في القنوات منها الأحمر والأخضر ، وحسبت كثافة GFP بضرب يعني الرمادي قيمة لكل بكسل من العدد الإجمالي للتعبير عن GFP – بكسل في كل القناة ، ثم إضافة تلك القيم على حد سواء للقنوات الأحمر والأخضر. جمعت قيم كثافة GFP لجميع النقاط الزمنية لانتاج 100 ملامح التعبير. أدت التغيرات في ملامح التعبير عن الاختلافات في GFP عوامل مثل قوة المروج ، القامع وجود التزام الصمت ، أو طبيعة المروج. بالإضافة إلى القياس الكمي للكثافة GFP ، كما استخدمت في سلسلة صورة لتوليد الوقت الفاصل بين الرسوم المتحركة باستخدام ImageReady ، و كشفت الوقت الفاصل بين الحركات التي غالبية واضحة من الخلايا عرض الزيادة السريعة نسبيا في التعبير GFP ، يعقبه انحدار بطيء. بعض الخلايا في بعض الأحيان عرض لفقدان مفاجئ لمضان ، والتي قد تترافق مع موت الخلايا السريعة. ولوحظ أيضا نقل الظاهر GFP عبر غشاء الخلية والجدار إلى الخلايا المجاورة. الفاصل الزمني المتحركة معلومات إضافية شريطة أن يكون على خلاف ذلك لا يمكن أن يتم الحصول عليها باستخدام ملامح واحدة أو شدة GFP مجموعات الصور الوقت نقطة.
استخدام الروبوتات وتطبيقات هائلة في مختلف جوانب الحياة البشرية ، على وجه التحديد ، تم الروبوتات تستخدم بفعالية لتنفيذ الأنشطة في بيئات خطرة ، لأتمتة أنشطة شاقة ومعقدة ، والقيام بالمهام بطريقة أكثر دقة. في البيولوجيا الجزيئية ، وعلى وجه التحديد التحليلات التعبير الجيني ، يمكن أن تساعد في تتبع الروبوتات ليس فقط ملامح الجينات ، بل أيضا نمو الأنسجة والتطور على مر الزمن. تحدث العديد من الظواهر البيولوجية بشكل حيوي ، والتي قد يكون من الصعب تتبع باستخدام نقطة واحدة الملاحظات الوقت.
استخدام الجين GFP للدراسات التعبير يجلب مزايا إضافية لمراقبة استجابة الأنسجة والنمو. لإجراءاتنا التجريبية ، GFP يسمح لنا لمتابعة التعبير الجيني في نفس قطعة من النسيج مع مرور الوقت كما هو GFP الكشف غير الهدامة. علاوة على ذلك ، لدينا نسخة من البروتين GFP غير مستقرة بما فيه الكفاية للسماح للكشف ولكنه يظهر أيضا بعض الدوران للحد من تراكم في أنسجة النبات ، مما يتيح لنا متابعة كل من صعود وهبوط في التعبير الجيني.
وقد استخدمت بالفعل نحن لدينا مجموعة الصور الروبوتية ونظام تحليل لمجموعة واسعة من التطبيقات. نتوقع إمكانية كبيرة لكثير من التطبيقات البيولوجية حيث هو المطلوب فهم الديناميكية لهذه الظاهرة. على سبيل المثال ، يمكن تتبع نمو وتطور الأنسجة النباتية باستخدام نظامنا يعطي نظرة قيمة / معلومات عن هذه العمليات. أيضا ، وديناميات النقل باستخدام جينات بروتين مثل مراسل GFP ، يمكن تصور بسهولة باستخدام الوقت الفاصل بين الرسوم المتحركة. المنهجية الموصوفة في هذا التقرير هو معقدة تقنيا ولكنها بسيطة من الناحية المفاهيمية. نتائجنا القوية والتي يتم اكتشافها باستمرار التطبيقات الجديدة التي يجري.
وقدمت رواتب ودعم البحوث من قبل المجلس فول الصويا المتحدة ، وعبر الولاية والحكومة الفيدرالية الأموال المخصصة للبحث الزراعي جامعة ولاية أوهايو / أوهايو ومركز تنمية كما أيد هذا البحث جزئيا من CONACYT الزمالة ، والمكسيك ، لCMHG. ذكر العلامة التجارية أو المنتجات ذات الملكية لا يشكل ضمانة أو ضمان للمنتج من قبل جامعة ولاية أوهايو / OARDC وأيضا لا يعني الموافقة على استبعاد غيرها من المنتجات التي قد تكون مناسبة أيضا. مجلة المادة لا HCS 09-17.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
ImageJ | Software | U. S. National Institutes of Health | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |