Toksin İndüksiyon ve Protein Ekstraksiyonu Fusarium Spp. Kültürler
Summary
Protein ekstraksiyonu mantar türlerinde proteomik analizleri için en az bir proteomik deney (MIAPE) kuralları hakkında bilgi göre, başarılı olmak için standardizasyon yüksek düzeyde gerektirir. Biz toksin indüksiyon ve protein izolasyonu sırasında deneysel önyargı en aza indirmek için bir prosedür içeren bir video protokol mevcut<em> Fusarium spp.</em
Abstract
Fusaria farklı toksinler üretebiliriz ipliksi mantarlar. Fusarium mikotoksinler deoksinivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric asit, moniliformin, vb gibi .. insan hem de hayvan sağlığı üzerindeki olumsuz etkileri ve bazı patojenite faktörleri olarak kabul edilmektedir. Proteomik çalışmalar Fusaria potansiyel patojenik faktörler (Kağıt ve diğerleri, 2007, Houterman ve ark, 2007) tanımlamak için toksin üretimi mekanizmaları (Taylor ve ark, 2008) yanı sıra çözmekte etkili olduğunu gösterdi. Bu nedenle, protein ekspresyonu deneyler, zorlama ve laboratuarlar arasındaki gerçek farklar bulundu güvenmek için proteomik çalışmalar arasında bir karşılaştırma için güvenilir yöntemler kurmak için temel haline gelir. Açıklanacaktır işlemi iki şekilde proteomik prosedürlerin standartlaştırılması artan bir düzeyde katkıda bulunmalıdır. Filme protokol tam olarak tarif edilebilir ayrıntıları seviyesini artırmak için kullanılır. Ayrıca, biyolojik bir süreç standart prosedürlerin mevcut ekstraksiyon prosedürü teknik tekrarlanabilirlik içinde insan faktörü de dikkate alınarak, daha yüksek bir veri sağlamlığı garanti çoğaltır.
Kültürler ve protein ekstraksiyonu (Şekil 1) için iki gün için ondört gün açıklanan protokol, onun tamamlanması için 16 gün gerektirir.
Kısaca, Fusarium suşları 4 gün boyunca katı ortam üzerinde yetişen, daha sonra el ile parçalanmış ve 10 gün boyunca, modifiye edilmiş bir toksin indükleyici medya (Jiao ve ark, 2008). aktarılır. Miselyum Miracloth bir katmanı sayesinde filtrasyon ile toplanır. Taşlama soğuk bir odasında yapılır. Farklı operatörler çıkarma yapılan teknik farklılıkları (Şekil 2) nedeniyle önyargı dikkate almak için (n = 3) çoğaltır. Ekstraksiyon Taylor ve ark açıklandığı gibi bir SDS / DTT tampon dayalı. (2008) hafif değişiklikler. Toplam protein izolasyonu Aseton / TCA / DTT tampon gecelik ve DTT / Aseton yıkama (Şekil 3a, 3b) kullanarak proteinlerin bir yağış süreci gerektiriyordu. Proteinler sonunda, protein etiketleme tampon resolubilized ve ölçüldü. Ekstraksiyon Sonuçları 2D jeller (IEF / SDS-PAGE) geçmeden önce, bir 1D jel (Şekil 4, SDS-PAGE) görüntülendi. Aynı prosedür, büyüyen diğer medya ve diğer ipliksi mantarlar (Miles ve ark, 2007) proteomik analizler için uygulanabilir .
Protocol
Discussion
Mantar biyoloji etki alanı içinde proteomik yaklaşımlar son zamanlarda ilgi, bu tekniği kullanarak (as Kim ve ark, 2007 gözden) yayınların sayısının artmasına yol açtı . Protein ekstraksiyon yöntemleri çıkarma prosedürlerinin kombinasyonu güveniyor; genellikle pek metodolojik bölümlerde açıklanan ve potansiyel sorun giderme yöntemleri ile ilgili uzmanlık gerektirir.
, Örnek ve veri işleme için standartları belirleyen diğer "omics" yaklaşımlar, güvenilir bilimsel bilgi üretmek için esastır. Ayrıca manipülasyon örnekleri ve prosedürleri farklı "omics" deneyler sonucu yorumlama arasında paylaşılan izin vermek için yeterince tarif edilmelidir. Bu tamamen genomik, proteomik, metabolomik, çapraz veri madenciliği potansiyellik istismar için gerekli olacaktır … (Morrison ve ark, 2006). Proteomik bir denemeyle ilgili asgari bilgileri bir denemenin bütün yönleriyle (Jel elektroforezi, Kütle Spektroskopisi, Moleküler Etkileşimler, Protein Değişiklikler, Proteomik Bilişim, Örnek İşleme) mücadele amacıyla hazırlanmıştır ve çalışma grupları kurulmuştur. Şu anda herhangi bir tanımlı bilgilerle örnek işleme prosedürleri mevcuttur. (Taylor ve ark, 2007) MIAPE kurallar çerçevesinde standardizasyon artırabilir prosedürleri uygulamak için, proteomik çalışmalar son kalitesini belirleyen protein çıkarma prosedürlerinin önemi göz önüne alındığında, biz örnek ayrıntılı bir video protokol önerdi işleme. Deneylerin video tanımı "omics" deneyler (Pasquali 2007) daha iyi tekrarlanabilirlik neden olabilir numune işleme hakkında bilgi sayısını artırmak için önemli ölçüde katkıda bulunabilir.
Gerçekten de, laboratuvarlar boyunca tekrarlanabilirliği proteomik sonuçları (http://www.fixingproteomics.org) geçerliliğini garanti altına almak için temel bir gerekliliktir. Farklı instrumentations ve farklı operatörler örnekleri manipüle: çapraz laboratuvar tekrarlanabilirliği iki faktör tarafından etkilenmektedir.
Açıklanan protokol, biz gerçekleştirmek için teklif biyolojik veriler (yani sonuçların teknik değişimi dikkate alınır) güvenilirliğini artırmak için birden fazla operatörleri (Şekil 2 ve video) içeren çoğaltır.
Protein ekstraksiyonu için açıklanan prosedür SDS ve ısıtma dayanmaktadır. Bu proteinlerin iyi bir saflık ve miktar (Bridge 1996), daha önce garanti gösterildi. SDS kaynatılarak ile birleştiğinde hücre duvarları, hidrofobik proteinler çözünür ve proteinlerin iptal yağış oligomerler oluşumunu önler. Kaynama proteazların inaktivasyonu da sağlar. Aynı etki, EDTA, PMSF ve tam mini proteaz inhibitörü tarafından da üretilir. DTT ve protein çözünmüş kolaylaştırılması proteinler arasındaki disülfit köprüleri kaldırır.
IEF önce SDS kaldırmak için, proteinler, aseton / TCA / DTT çöktürülür. Ayrıca, bu bileşiklerin mevcut olduğunda, yağlar, nükleik asitler, tuzlar veya / ve fenolik bileşikler gibi bazı yabancı maddelerden kaldırarak aseton / TCA / DTT yağış sağlar. SDS gibi, bu molekülleri IEF sırasında iyi bir göçü önlemek. Bu yağış sonrasında, IEF ile müdahale gibi TCA kaldırmak için aseton / DTT, çöktürülmüş proteinleri yıkamak için gereklidir.
İyi bir numune hazırlama, iyi sonuçlar için bir anahtardır. Bunun için, çevre proteinlerin toz ücretsiz eldiven ile çalışan ve iyi laboratuvar uygulamalarına saygı kirlenmesini önlemek için de gereklidir. Teknik açıdan, açıklanan protokol dahilinde, iki aşamada proteinlerin yeterli miktarda ve saflık elde etmek için en kritik adımlar. İlk olarak, öğütme hücrenin tam imha proteinler serbest bırakmak için temel aşaması ve ikinci, toplam proteinlerin saflaştırılması, lipid, DNA ve proteinlerin göç ile parazite neden olabilecek diğer kirleticiler çoğunluğu kaldırılması kapsayan bir faz.
Acknowledgements
Servane Contal ve Boris Untereiner Biz kendi teknik katkılarından dolayı teşekkür ederim. Biz FNR "FUTOX" projesi destek kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
Media and solutions
PDA: 39 g Potato Dextrose Agar (Difco); 1 L distilled water.
V8 agar: 200 ml V8 (campbell’s, USA), 2g CaCO3 (Sigma), 16g Agar (DIFCO), 800 ml distilled water
Toxin inducing media: 1g K2HPO4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4 7H2O, 10 mg FeEDTA, 2g L glutamic acid, 10g sucrose in 1L of distilled water.
Lysis Buffer:
| 100mL | Final concentration | ||
| Tris-HCL pH8 | 5mL | 50mM | 1M |
| SDS | 2g or 10mL | 2% | 20% |
| DTT | 500mL | 10mM | 2M |
| EDTA | 20mL | 0.1mM | 0.5M |
| PMSF | 200mL | ||
| Complete mini protease inhibitor | 1 tablet | ||
| Water | Qsp |
Precipitation Buffer:
| 100mL | Final concentration | |
| TCA | 20mL | 20% |
| DTT | 0.1mL | 0.1% |
| Aceton | Qsp |
Washing Buffer:
| 100mL | Final concentration | |
| DTT | 0.1mL | 0.1% |
| Aceton | 100mL |
Labelling Buffer (store at -18°C in small aliquots):
| 1mL | Final concentration | |
| Urea | 140 mg | 7M |
| Thiourea | 50 mg | 2M |
| CHAPS | 40 mg | 4% |
| Tris | 30 µL | 30 mM |
| Water | 1 mL |
Referências
- Bridge, P. Protein Extraction from Fungi. Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).
- Jiao, F. Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture. FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).
- Kim, Y. Proteomics of filamentous fungi. Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).
- Milles, J. Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds. Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).
- Morrison, N., Field, D. Concept of sample in OMICS technology. OMICS. 10, 127-137 (2006).
- O’Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. PNAS. 95, 2044-2049 (1998).
- Paper, J. M. Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum. Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).
- Pasquali, M. Video in science. Protocol videos: the implications for research and society. EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).
- Taylor, C. F. The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE). Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).
- Taylor, R. D. Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions. Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).
