Indução toxina e Extração de Proteínas de Fusarium Spp. Culturas de Estudos Proteômica
Summary
Extração de proteínas para análise proteômica em espécies de fungos requer um alto nível de padronização a ser realizado de acordo com as informações mínimas sobre um experimento proteômica (MIAPE) orientações. Nós apresentamos um vídeo protocolo que inclui um procedimento para minimizar viés experimental durante a indução da toxina e extração de proteínas de<em> Fusarium spp.</em
Abstract
Fusaria são fungos filamentosos capazes de produzir toxinas diferentes. Micotoxinas Fusarium, como o desoxinivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, ácido fusárico, moniliformin, etc .. ter efeitos adversos na saúde humana e animal e alguns são considerados como fatores de patogenicidade. Estudos de proteômica mostrou-se eficaz para decifrar os mecanismos de produção de toxinas (Taylor et al., 2008), bem como para a identificação de fatores patogênicos em potencial (Paper et al. 2007, Houterman et al., 2007) em Fusaria. Torna-se, portanto, fundamental para estabelecer métodos confiáveis para a comparação entre os estudos de proteômica, a fim de contar com verdadeiras diferenças encontradas na expressão da proteína entre os experimentos, as cepas e laboratórios. O procedimento que será descrito deverá contribuir para um maior nível de padronização de procedimentos proteômica de duas maneiras. O protocolo filmado é usado para aumentar o nível de detalhes que pode ser descrito com precisão. Além disso, a disponibilidade de procedimentos padronizados para processo biológico replica deve garantir uma maior robustez dos dados, tendo em conta também o fator humano dentro da reprodutibilidade técnica do processo de extração.
O protocolo descrito requer 16 dias para sua conclusão: 14 dias para as culturas e dois dias para a extração de proteínas (figura 1).
Resumidamente, Fusarium cepas são cultivadas em meios sólidos por 4 dias, pois eles são, então, manualmente fragmentado e transferido para uma mídia toxina modificada indução (Jiao et al, 2008.) Por 10 dias. Micélio é coletado por filtração através de uma camada Miracloth. Moagem é realizada em uma câmara fria. Diferentes operadores realizada extração de repetições (n = 3), a fim de ter em conta o viés devido a variações técnica (figura 2). Extração foi baseado em um tampão SDS / TDT conforme descrito em Taylor et al. (2008) com ligeiras modificações. Extração de proteína total necessário um processo de precipitação das proteínas com acetona / TCA / TDT tampão de lavagem durante a noite e acetona / TDT (figura 3a, 3b). Proteínas foram finalmente ressolubilizam no buffer de proteína rotulagem e quantificados. Resultados da extração foram visualizados em gel 1D (Figura 4, SDS-PAGE), antes de prosseguir para 2D géis (IEF / SDS-PAGE). O mesmo procedimento pode ser aplicado para análises proteômicas em outros suportes de cultura e outros fungos filamentosos (Miles et al., 2007).
Protocol
Discussion
Recente interesse em abordagens proteômicas no domínio da biologia de fungos levou a um aumento do número de publicações com essa técnica (como revistas em Kim et al., 2007). Métodos para a extração de proteínas dependem de uma combinação de procedimentos de extração, que são muitas vezes mal descritos nas seções metodológicas e requerem conhecimento especializado para lidar com os métodos de solução de problemas em potencial.
Como para outros "ómicas" abordagens, estabelecendo normas para o processamento de amostras e dados é essencial a fim de gerar informações científicas confiáveis. Além disso as amostras e os procedimentos de manipulação devem ser adequadamente descritos de modo a permitir interpretação dos resultados compartilhados entre os diferentes "ómicas" experimentos. Isso seria essencial para a plena exploração do potencial cross-de mineração de dados em genômica, proteômica, metabolômica, … (Morrison et al., 2006). Informações mínimas sobre um experimento proteômica foi elaborado e grupos de trabalho foram criados de forma a gerir todos os aspectos de uma experiência (de eletroforese em gel, Espectrometria de Massa, interações moleculares, modificações de proteínas, Informática Proteomics, o processamento da amostra). No momento nenhuma informação definida estão disponíveis em procedimentos de processamento da amostra. Dada a importância dos procedimentos de extração da proteína para determinar a qualidade final dos estudos de proteômica, a fim de implementar procedimentos que podem aumentar a padronização no âmbito das diretrizes MIAPE (Taylor et al., 2007), propusemos o uso de um protocolo de vídeo detalhando amostra processamento. Descrição do vídeo de experimentos pode contribuir substancialmente para aumentar o número de informações sobre o processamento da amostra, que pode resultar em melhor reprodutibilidade de "ómicas" experimentos (Pasquali, 2007).
Na verdade, toda a reprodutibilidade laboratórios é um requisito fundamental para garantir a validade dos resultados proteômica (http://www.fixingproteomics.org). A reprodutibilidade cruz laboratório é influenciado por dois fatores: instrumentações diferentes e diferentes operadores manipulando as amostras.
No protocolo descrito, propomos a realizar replica biológica envolvendo múltiplos operadores (Figura 2 e vídeo) para aumentar a confiabilidade dos dados (ou seja, variação da técnica dos resultados é levado em conta).
O procedimento descrito para a extração de proteínas é baseado em SDS e aquecimento. Isto foi demonstrado anteriormente para garantir uma pureza e boa quantidade de proteínas (Bridge, 1996). SDS juntamente com ebulição dissolve as paredes das células, as proteínas hidrofóbicas e impede a formação de oligômeros que a precipitação de proteínas abortar. Ebulição permite também a inativação de proteases. O mesmo efeito é produzido também por EDTA, PMSF e inibidor da protease completa mini. TDT remove pontes dissulfeto e entre proteínas facilitando a solubilização da proteína.
A fim de remover antes IEF SDS, as proteínas são precipitadas por acetona / TCA / TDT. Além disso, acetona / TCA / TDT precipitação permite remover alguns contaminantes, tais como lipídios, ácidos nucléicos, sais e / ou compostos fenólicos, quando estes compostos estão presentes. Como SDS, estas moléculas evitar uma migração bem durante IEF. Seguindo essa precipitação, é necessário lavar as proteínas precipitadas com acetona / DTT, a fim de remover TCA, pois ele pode interferir com IEF.
A preparação da amostra boa é a chave para bons resultados. Para isso, é também essencial para evitar a contaminação de proteínas do ambiente de trabalho com luvas sem pó e respeitando as boas práticas laboratoriais. Do ponto de vista técnico, dentro do protocolo descrito, os passos mais críticos para obtenção de quantidades suficientes e pureza de proteínas são duas fases. Primeiro, a fase de moagem onde a destruição completa da célula é fundamental para a liberação de proteínas e, segundo, a purificação de proteínas totais, uma fase que engloba a remoção da maioria dos lipídios DNA, e outros contaminantes que possam interferir com a migração de proteínas.
Acknowledgements
Agradecemos a Servane Contal e Boris Untereiner por sua contribuição técnica. Agradecemos o apoio da FNR "FUTOX" do projeto.
Materials
Media and solutions
PDA: 39 g Potato Dextrose Agar (Difco); 1 L distilled water.
V8 agar: 200 ml V8 (campbell’s, USA), 2g CaCO3 (Sigma), 16g Agar (DIFCO), 800 ml distilled water
Toxin inducing media: 1g K2HPO4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4 7H2O, 10 mg FeEDTA, 2g L glutamic acid, 10g sucrose in 1L of distilled water.
Lysis Buffer:
| 100mL | Final concentration | ||
| Tris-HCL pH8 | 5mL | 50mM | 1M |
| SDS | 2g or 10mL | 2% | 20% |
| DTT | 500mL | 10mM | 2M |
| EDTA | 20mL | 0.1mM | 0.5M |
| PMSF | 200mL | ||
| Complete mini protease inhibitor | 1 tablet | ||
| Water | Qsp |
Precipitation Buffer:
| 100mL | Final concentration | |
| TCA | 20mL | 20% |
| DTT | 0.1mL | 0.1% |
| Aceton | Qsp |
Washing Buffer:
| 100mL | Final concentration | |
| DTT | 0.1mL | 0.1% |
| Aceton | 100mL |
Labelling Buffer (store at -18°C in small aliquots):
| 1mL | Final concentration | |
| Urea | 140 mg | 7M |
| Thiourea | 50 mg | 2M |
| CHAPS | 40 mg | 4% |
| Tris | 30 µL | 30 mM |
| Water | 1 mL |
Referências
- Bridge, P. Protein Extraction from Fungi. Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).
- Jiao, F. Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture. FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).
- Kim, Y. Proteomics of filamentous fungi. Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).
- Milles, J. Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds. Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).
- Morrison, N., Field, D. Concept of sample in OMICS technology. OMICS. 10, 127-137 (2006).
- O’Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. PNAS. 95, 2044-2049 (1998).
- Paper, J. M. Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum. Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).
- Pasquali, M. Video in science. Protocol videos: the implications for research and society. EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).
- Taylor, C. F. The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE). Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).
- Taylor, R. D. Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions. Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).
