La microinyección de ADN en intranucleares disociada neuronas de mamíferos adultos

I. Preparación para la inyección Esta sección describe los pasos de preparación que deben tomarse antes de la inyección de cDNA en el núcleo de las neuronas. El procedimiento de aislamiento de las neuronas está fuera del alcance de este artículo, pero es importante que las neuronas disociadas en las células individuales y adherirse bien a la superficie inferior de 35 placas de cultivo celular mm (véase la discusión de consejos útiles para lograr esto). Aunque una variedad de diferentes neuronas podría ser utilizado, los ganglios periféricos, tales como los ganglios cervical superior (SCG) o los ganglios de la raíz dorsal son los preferidos para la disección, porque son de fácil acceso y el rendimiento de un gran número de neuronas. Otras ventajas de la utilización de las neuronas SCG es que son una población relativamente homogénea de las células y bien caracterizados 1,2,3,4. A. Preparación del plásmido cDNA para la inyección Para evitar la contaminación o degradación del ADN, se deben usar guantes durante la preparación. ADN que codifica la proteína de interés se subclona en un vector de expresión adecuado de mamíferos, tales como PCI (Promega, Madison, WI), bajo el control del citomegalovirus muy activa y constitutiva (CMV). Si la proteína no está etiquetado, un plásmido reportero, EGFP codificación, por ejemplo (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), es co-inyección para confirmar el éxito de la inyección y la expresión. El ADN es aislado mediante una columna de separación de alta calidad (por ejemplo, QIAfilter Midi-prep kit, Qiagen, Chatsworth, CA) y se purifica aún más con una unidad de filtro centrífugo con un filtro PVDF (0,1 micras, Millipore, Bedford, MA) para eliminar las partículas en el preparación de plásmidos, que pueden obstruir las pipetas de inyección durante el proceso de inyección. Los plásmidos son almacenadas a -20 ° C a una concentración de aproximadamente 1 mg / l en un buffer de ADN de almacenamiento adecuado (por ejemplo, tampón TE: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). Inmediatamente antes de la microinyección, ADNc del plásmido se diluyen y se mezcla con la concentración final deseada en buffer TE o H 2 O. Por lo general, 5-10 ng / l del gen reportero es suficiente para marcar a las células inyectadas, y la concentración total de cDNA para ser inyectado no debe superar los 200 ng / l ya que el ADN es viscoso en altas concentraciones y puede obstruir las pipetas de inyección. Un pequeño volumen de cDNA para la inyección (50 a 10 l) se prepara mezclando gotas de la solución sobre la superficie limpia de un pequeño trozo de Parafilm (lateral por debajo del soporte de papel). Mezclar las gotas de la solución, junto con pipeta hacia arriba y abajo varias veces con un pipetor y evitar la introducción de burbujas de aire durante la mezcla. Usando una punta de pipeta microloader (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), la transferencia de la solución de cDNA a un tubo de hematocrito especialmente preparado (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Vea la sección de materiales para obtener instrucciones sobre la preparación de los tubos de hematocrito (Tabla de Materiales). Coloque el tubo de hematocrito que contiene la solución inyectable de cDNA en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar el tubo durante 15-30 min a 10 000 g en una microcentrífuga equipado con un rotor de cubeta de ángulo fijo o balanceo (Eppendorf), a temperatura ambiente (20-24 ° C) a las partículas de sedimento en la solución de cDNA que pueda bloquear las microinyección pipeta. La solución inyectable de ADNc se pueden mantener a temperatura ambiente durante la sesión de la inyección. B. La fabricación de pipetas de inyección Pipetas desechables microinyección de vidrio están disponibles comercialmente (por ejemplo, Femtotips, Eppendorf), que son convenientes, pero caro ($ 10 por pipeta de microinyección). Pipetas de inyección se pueden fabricar en el laboratorio usando un P-97 programable extractor Flaming pipeta Brown (Empresa Sutter Instrument, Novato, CA) y filamented, de paredes delgadas tubos capilares de borosilicato (Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota, FL). Esta opción es más rentable y permite el control de la forma y el tamaño de pipeta de microinyección. Un programa de dos etapas se utiliza para tirar estrechas puntas de pipeta de microinyección. Desde la apertura de pipetas de microinyección es demasiado estrecho para examinarla bajo el microscopio de luz, la calidad de las pipetas de inyección tienen que ser evaluadas directamente mediante la inyección de unas pocas células antes de la configuración del programa se finalicen. Los siguientes son los valores aproximados para los ajustes de calor, la atracción, la velocidad y el tiempo: (la 1) 600, 115, 15, 250, (pull 2) 640, 130, 65, 200. Estos valores varían con diferentes lotes de vidrio y por la condición de que el filamento de calentamiento en el extractor, y debe ajustarse según sea necesario. Para más detalles véase el punto 5. Tire de varias (2-5) pipetas de inyección por plato de neuronas que se inyecta, en caso de daños o problemas durante la sesión de la inyección. Tienda de pipetas de inyección en un recipiente tapado para evitar que entre polvo en la punta de la pipeta de microinyección. II. Microinyección intranucleares tienda de campaña "> En esta sección se detalla el proceso de inyección de cDNA en el núcleo de las neuronas. Una microinyección de configuración básica incluye una fase invertida microscopio de contraste (por ejemplo, Nikon Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY) para visualizar el proceso, micromanipulador (por ejemplo, Eppendorf 5171) para controlar el movimiento de la pipeta de inyección y una presión de inyección (por ejemplo, Eppendorf FemtoJet Express) para expulsar a la solución de cDNA a partir de la pipeta. Conexión de la presión de inyección para el micromanipulador permite la sincronización de los dos últimos procesos durante las inyecciones. Otros opcional, pero altamente recomendable, componentes incluyen un sistema de video vigilancia montado (cámara CCD, Cohu Inc., San Diego, CA, en blanco y negro monitor de vídeo, Sony Corporation, Tokio, Japón). Este sistema no es un requisito absoluto para inyecciones; Sin embargo, el monitor en blanco y negro ofrece un alto contraste para una mejor visualización del núcleo celular y ofrece una experiencia de visualización más cómoda durante las sesiones de inyección de largo. Además, un ordenador portátil con software para operar un controlador de mano se puede utilizar para semi- automatizar el proceso de inyección (véase la discusión para más detalles). El momento ideal para inyectar las neuronas SCG es de 3-6 horas después de la disociación. En esta etapa, las células son esféricas, muy bien fijadas a la parte inferior del plato, y el núcleo es claramente visible, con un microscopio de contraste de fase, como un centro de orgánulos ronda con una membrana oscura, que contiene una sola o múltiples nucleolos (Figura 1A). Coloque un plato de neuronas disociadas en el centro de la platina del microscopio. Ajustar el enfoque y optimizar la óptica de contraste de fase del microscopio de modo que el núcleo de las neuronas son claramente visibles. Pipeta de 2 l de solución preparada cDNA en una pipeta de microinyección con una punta de pipeta microloader. Que elaborar una solución en la parte inferior del tubo de hematocrito, ya que podría despertar las partículas que se establecieron durante la centrifugación. El filamento de la pipetas de microinyección debe ayudar en la elaboración de una solución a la punta, pero si persisten las pequeñas burbujas de aire, dé golpecitos en el lado del vidrio para desalojarlos. Inserte la pipeta de microinyección en el titular de la presión capilar de inyección y asegurar el soporte para el micromanipulador. El soporte se fija en un ángulo de 45 °. Baje la pipeta de microinyección en el plato. A medida que la pipeta entre en el medio de cultivo, el menisco se forma que afecta a la refracción de la luz y reduce la calidad de la imagen de las neuronas. Para aliviar este problema, la torre del anillo de fase puede ser ligeramente desplazado hasta el núcleo de las neuronas son claramente visibles de nuevo. Algunos sistemas de inyección a alta presión tienen una "limpia" la función que se aplica la presión máxima del aire de la punta de la pipeta de microinyección de un corto período. Utilice esta función para borrar la pipeta de escombros antes de comenzar y durante las inyecciones si la punta aparece tapado. Si el líquido disipado no es visible en la pantalla mientras se utiliza esta función, vuelva a colocar con una pipeta nueva inyección. El centro de la pipeta de microinyección en el monitor de visualización y alinear la punta al lado de una neurona y en el mismo plano focal que el nucléolo. Establecer esta posición como la más baja del eje z límite en el micromanipulador. Esta posición es la profundidad de la pipeta de microinyección avanzarán a durante las inyecciones. Ahora la posición de la punta de unos 30 m por encima de este punto para la pipeta de microinyección elimina la parte superior de las neuronas. El "inyectar" el modo de un micromanipulador Eppendorf 5171 se puede definir con los siguientes valores para realizar inyecciones intranucleares. La función de inyectar está activada, mientras que la función es atravesar la dejó. Un camino de inyección de diagonal (a lo largo del X y Z) produce la menor cantidad de daño celular, y por lo tanto el modo axial se debe utilizar para preparaciones inyectables. Una velocidad de inyección de 300 m / s es suficiente, y sincronizar la acumulación de presión cuando la pipeta de microinyección alcanza el conjunto del eje z límite. La presión de inyección controla la cantidad de solución de cDNA se inyecta en el núcleo. En el modo "automático" de la inyección, la entrega de ADN es controlada en el tiempo e iniciado por el micromanipulador conectado. La presión de inyección (Pi) se debe establecer entre 100 a 200 hectopascales (hPa, 1 hPa ~ 0,015 psi); mayores presiones de inyección no mejoran las tasas de éxito o la calidad de las inyecciones y puede indicar otros problemas con el tamaño de la microinyección de ADN punta de la pipeta o la pureza . Una duración de la inyección (TI) de 0,3 s y una compensación de presión (Pc), de 30 hPa, que suministra una presión positiva constante para evitar la entrada de oclusión de las partículas del medio de cultivo en la punta de la pipeta, se debe utilizar. Posición de la neurona que se inyecta debajo de la punta de la pipeta de microinyección con el microscopio de xy el eje de control de la etapa. Alinee la punta de la pipeta por encima del centro del núcleo, centrándose ida y vuelta entre tque la punta y el nucléolo. Inyectar el núcleo pulsando el botón de inyección (en el micromanipulador). Para el paso de la inyección, el movimiento de la pipeta de microinyección y el lanzamiento de la solución de cDNA son controlados por el micromanipulador. Es difícil confirmar el éxito inyecciones intranucleares a ojo, pero la inyección de la solución de viscosidad relativamente baja cDNA (en comparación con el medio ambiente nuclear viscoso), a menudo aparece como un penacho blanco bajo la óptica de contraste de fase y se puede utilizar como un indicador de inyección en el núcleo. A veces la pipeta de microinyección no penetra en la membrana nuclear y simplemente empuja el núcleo. Un intento de la segunda inyección en la misma posición puede conducir a un éxito de la inyección de ADN en el núcleo. Hinchazón de la célula es generalmente indicativo de la inyección citoplasmática no intencional. Además, la hinchazón significativa nuclear no es bien tolerado por las neuronas y generalmente resulta en la muerte celular poco después, por lo que la presión de inyección y la duración no debe superar los valores sugeridos. Continuar inyectando neuronas mediante el reposicionamiento de la platina del microscopio para alinear la siguiente neurona en la pipeta de microinyección. Sistemáticamente navegar a través de la antena para inyectar aproximadamente 50 a 100 núcleos antes de devolver el plato de las neuronas a la incubadora de incubación durante la noche. Neuronas con éxito inyectada puede ser identificado al día siguiente por la expresión del gen reportero. III. Resultados representante Figura 1: ganglio cervical superior (SCG), las neuronas. La imagen de contraste de fase de las neuronas SCG 3 horas después de la disociación (A). En esta etapa, el núcleo se ve claramente que ayuda a la alineación de la punta de la pipeta de microinyección. El núcleo aparece en el centro de las neuronas con una sola (izquierda) o múltiples (derecha) nucleolos oscuros. SCG neuronas 16 horas después de la inyección de EGFP cDNA en el núcleo (B). Izquierda, SCG neuronas se observa bajo la iluminación de contraste de fase. Derecha, imagen de epifluorescencia de las mismas neuronas que muestra la inyección con éxito y que resulta la expresión EGFP en una neurona. Barra blanca escala es de 20 micras. Figura 2: Plenario de células grabaciones de las corrientes a través de heteróloga-expresado acoplados a proteína G por dentro rectificación de K + (GIRK) canales de las neuronas SCG. GIRK corrientes (I GIRK) fueron evocados por una rampa de voltaje de 200 ms -140 a 40 mV desde un potencial de mantenimiento de -60 mV (en el recuadro de la A) tras la activación endógena de α 2-adrenérgicos de norepinefrina (NE, 10 M) . Huellas superpuestas son las grabaciones de la misma neurona e indicar antes (negro) y después de la aplicación de cualquiera de NE solo (azul) o NE más de 10 mM Ba 2 + (rojo). Las líneas discontinuas indican el nivel actual de cero. Para la grabación de I GIRK, la solución externa que contiene (en mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 10 HEPES, 10 de CaCl 2, 0,8 MgCl 2, 15 glucosa, sacarosa 15, y 0,0003 TTX, ajustada a pH 7,4 con NaOH. La solución de grabación interna contenía (en mM) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 4 MgATP, y el 0,3 Na 2 GTP, ajustado a pH 7,2 con KOH. La falta de corriente provocada por la rampa de tensión en la presencia de NE en las neuronas SCG no inyectadas (A) demuestra que las neuronas SCG no expresan canales GIRK endógeno. Inyección de éxito de un plásmido que codifica cDNA funcional GIRK canal 11 da lugar a grandes corrientes en la rampa de tensión cuando se expone al NE (B, izquierda). Corrientes tienen las características típicas de las corrientes a través de canales GIRK: la activación de un agonista de los receptores acoplados a proteína G (NE), rectificación hacia adentro, y el bloque de corrientes por el bloqueador del canal GIRK supuesto, Ba 2 + (B, derecha trazo rojo). Los círculos vacíos y llenos representan I GIRK en la explotación y el pico de corriente, respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 2.