Intranukleäre Mikroinjektion von DNA in Dissoziierte Adult Mammalian Neurons

I. Vorbereitung zur Injektion Dieser Abschnitt beschreibt die vorbereitenden Schritte, die vor der Injektion cDNA in den Zellkern von Neuronen ergriffen werden müssen. Die Isolierung Verfahren für die Neuronen würde den Rahmen dieses Artikels, aber es ist wichtig, dass Neuronen dissoziiert in einzelne Zellen und die Einhaltung auch zu der unteren Fläche von 35 mm Zellkulturschalen (siehe Diskussion für hilfreiche Tipps, um dieses Ziel zu erreichen). Obwohl eine Vielzahl von verschiedenen Neuronen möglicherweise genutzt werden könnten, sind periphere Ganglien, wie die überlegene Halsganglien (SCG) oder der Spinalganglien für die Präparation bevorzugt, weil sie bequem zugänglich und ergeben eine große Anzahl von Neuronen. Zusätzliche Vorteile der Verwendung von SCG Neuronen sind, dass sie eine relativ homogene Population von Zellen und 1,2,3,4 gut charakterisierten. A. Herstellung von Plasmid-cDNA zur Injektion Um zu verhindern, Verschmutzung oder Ausfall der DNA, sollte Handschuhe während der Vorbereitung getragen werden. DNA, die das Protein von Interesse in einen geeigneten Säugerexpressionsvektor, wie PCI (Promega, Madison, WI), nach der Verordnung über die hoch und konstitutiv aktiven Cytomegalievirus (CMV)-Promotor subkloniert. Wenn das Protein nicht gekennzeichnet ist, ein Reporter-Plasmid, die Verschlüsselung mit EGFP zum Beispiel (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), co-injiziert, um erfolgreiche Injektion und Expression zu bestätigen. DNA isoliert mit einer hochwertigen Trennsäule (zB QIAfilter Midi-Prep-Kit, Qiagen, Chatsworth, CA) und weiter gereinigt durch eine zentrifugale Filtereinheit mit einem PVDF-Filter (0,1 um, Millipore, Bedford, MA), um Partikel in den entfernen Plasmid-Präparation, die Injektion Pipetten während der Injektion Prozess zu behindern. Plasmide sind bei -20 ° C bei einer Konzentration von etwa 1 ug / ul in eine geeignete DNA Pufferspeicher (: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 zB TE-Puffer) gespeichert. Unmittelbar vor der Mikroinjektion werden Plasmid-cDNAs verdünnt und auf die gewünschte Endkonzentration in TE-Puffer oder H 2 O. gemischt In der Regel 5-10 ng / ul des Reportergens ist ausreichend, um injizierten Zellen Etikett, und die gesamte Konzentration der cDNA injiziert werden sollte nicht mehr als 200 ng / ul seit DNA ist zähflüssig in hohen Konzentrationen und kann die Injektion Pipetten verstopfen. Ein kleines Volumen der cDNA für die Injektion (5-10 ul) wird durch Mischen von Tropfen der Lösung auf der sauberen Oberfläche ein kleines Stück Parafilm (Seite unter dem Papierträger) vorbereitet. Mischen Sie die Tropfen der Lösung zusammen durch Pipettieren nach oben und unten mehrmals mit einem pipetor und vermeiden Sie die Einführung von Luftblasen beim Mischen. Mit einem Microloader Pipettenspitze (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), übertragen Sie die cDNA-Lösung, um eine speziell vorbereitete Hämatokrit Rohr (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Siehe Materialien Abschnitt Anweisungen zur Vorbereitung Hämatokritröhrchen (Werkstoff-Tabelle). Setzen Sie den Hämatokrit Rohr mit dem cDNA-Injektionslösung in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 15-30 min bei 10 000 g in einer Mikrozentrifuge mit einem festen Winkel oder Ausschwingrotor (Eppendorf) ausgestattet, bei Raumtemperatur (20-24 ° C), um Schmutzpartikel in der cDNA-Lösung, kann der Block Mikroinjektion Pipette. Die cDNA-Injektionslösung kann bei Raumtemperatur während der Injektion Sitzung gehalten werden. B. Herstellung der Injektion Pipetten Einweg-Glas-Mikroinjektion Pipetten sind im Handel erhältlich (z. B. Femtotips, Eppendorf), die praktisch, aber teuer ($ 10 pro Mikroinjektion Pipette). Injection Pipetten können im Labor unter Verwendung eines programmierbaren P-97 Flaming Brown pipet Puller (Sutter Instrument Company, Novato, CA) und filamented, dünnwandige Borosilikatglas Kapillaren (World Precision Instruments, Sarasota, FL) hergestellt werden. Diese Option ist kostengünstiger und ermöglicht die Steuerung der Mikroinjektion pipet Form und Größe. Ein Zwei-Stufen-Programm wird verwendet, um schmale Mikroinjektion Pipettenspitzen zu ziehen. Seit der Eröffnung der Mikroinjektion Pipetten ist zu schmal, um unter einem Lichtmikroskop untersucht, die Qualität der Injektion Pipetten direkt durch die Injektion von ein paar Zellen, bevor das Programm die Einstellungen abgeschlossen sind ausgewertet werden. Die folgenden sind ungefähre Einstellungen für Wärme, ziehen, Geschwindigkeit und Zeit-Einstellungen: (Pull-1) 600, 115, 15, 250; (Pull-2) 640, 130, 65, 200. Diese Einstellungen variieren mit unterschiedlichen Chargen von Glas und von der Beschaffenheit der Heizfaden in der Abzieher und sollte nach Bedarf eingestellt werden. Weitere Details finden Sie 5. Ziehen Sie mehrere (2-5) Injektion Pipetten pro Schale von Neuronen, die injiziert, im Falle der Beschädigung oder Probleme während der Injektion Sitzung. Shop Injektion Pipetten in einem abgedeckten Behälter für das Eindringen von Staub Mikroinjektion Pipettenspitze zu verhindern. II. Intranukleäre Mikroinjektion Zelt "> Dieser Abschnitt erläutert die Verfahren der Injektion von cDNA in den Zellkern von Neuronen. Eine grundlegende Mikroinjektion Set-up umfasst eine umgekehrte Phasen-Kontrast-Mikroskop (zB Nikon Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY), um den Prozess zu visualisieren, Mikromanipulator (z. B. Eppendorf 5171), um die Bewegung der Injektion Pipette und einem Injektor (zB Eppendorf FemtoJet Express) Kontrolle der cDNA-Lösung aus der Pipette zu vertreiben. Anschließen der Injektor den Mikromanipulator erlaubt die Synchronisation der beiden letztgenannten Prozesse während der Injektionen. Andere optional, aber dringend empfohlen, gehören Komponenten montierten Video-Überwachungssystem (CCD-Kamera, Cohu Inc., San Diego, CA; Schwarz-Weiß-Video-Monitor, Sony Corporation, Tokio, Japan). Dieses System ist nicht eine absolute Voraussetzung für Injektionszwecke; bietet aber die schwarzen und weißen Monitor mit hohem Kontrast für bessere Visualisierung des Zellkerns und bietet eine komfortablere Seherlebnis bei langen Injektion Sitzungen. Darüber hinaus, ein Laptop-Computer-Software, um eine Hand-held-Controller zu betreiben, um semi-eingesetzt werden können Automatisierung der Einspritzung (siehe Diskussion für weitere Details). Die ideale Zeit für SCG Neuronen injiziert wird 3-6 Stunden nach der Dissoziation. In diesem Stadium werden die Zellen kugelig, dicht an der Unterseite der Schale befestigt, und der Kern ist deutlich sichtbar, unter einem Phasen-Kontrast-Mikroskop, als eine zentrale runde Organelle mit einem dunklen Membran, die ein einzelnes oder mehrere Nukleolen (Abb. 1A). Legen Sie eine Schüssel mit dissoziierten Neuronen in der Mitte des Mikroskoptisches. Stellen Sie den Fokus und Optimierung der Phasenkontrast-Optik des Mikroskops so den Kernen der Nervenzellen deutlich sichtbar sind. Pipet 2 ul vorbereitet cDNA-Lösung in eine Mikroinjektion Pipette mit einem Microloader Pipettenspitze. Vermeiden Sie die Erstellung Lösung in der Nähe der Unterseite des Hämatokrit Rohr, da dies zu schüren Partikel, die während der Zentrifugation angesiedelt. Der Faden in der Mikroinjektion Pipetten sollten bei der Erstellung Lösung für die Spitze Hilfe, aber wenn kleine Luftblasen bestehen, sanft Flick die Seite des Glases, um sie zu vertreiben. Legen Sie die Mikroinjektion Pipette in die Kapillare Inhaber der Injektor und sichern Sie die Halterung an der Mikromanipulator. Der Halter ist in einem 45 ° Winkel fixiert. Senken Sie die Mikroinjektion Pipette in die Schüssel. Wie der Pipette in die Nährlösung, ist ein Meniskus gebildet, wirkt sich auf die Brechung des Lichts und senkt die Bildqualität der Neuronen. Um dieses Problem zu beheben, kann die Phase Ring Revolver leicht versetzt werden, bis die Kerne von Neuronen deutlich wieder sichtbar werden. Einige Einspritzsysteme haben eine "saubere"-Funktion, die maximale Luftdruck von der Mikroinjektion Pipettenspitze für eine kurze Dauer gilt. Verwenden Sie diese Funktion, um die Pipette von Schutt vor Beginn und während der Injektion, wenn die Spitze scheint verstopft zu löschen. Wenn ausgeräumt Flüssigkeit ist nicht auf dem Bildschirm sichtbar, wenn Sie diese Funktion mit einer neuen Injektion Pipette ersetzen. Zentrum der Mikroinjektion Pipette in die Betrachtung überwachen und richten Sie die Spitze neben einem Neuron und in der gleichen Bildebene als Nukleolus. Setzen Sie diese Position als die untere z-Achse Begrenzung der Mikromanipulator. Diese Position ist die Tiefe der Mikroinjektion Pipette während Injektionen voraus. Positionieren Sie nun die Spitze etwa 30 um über diesen Punkt, so dass die Mikroinjektion pipet löscht die Spitze der Neuronen. Die "injizieren" Modus einer Eppendorf 5171 Mikromanipulator kann mit den folgenden Einstellungen definiert werden, um intranukleären Injektionen durchführen. Die Injektion Funktion aktiviert ist, während die aufspießen Funktion links ist. Eine diagonale Injektion Weg (entlang der x-und z-Achse) ergibt den geringsten Zellschäden und damit die axiale Modus sollte für Injektionen verwendet werden. Eine Injektion von 300 mu m / s ist ausreichend, und synchronisieren Druckaufbau, wenn die Mikroinjektion pipet Erreichen des eingestellten z-Achse zu beschränken. Der Injektor steuert die Menge des cDNA-Lösung in den Zellkern gespritzt. In der "automatischen" injection-Modus wird die Abgabe von DNA zeit-und initiiert durch die angeschlossene Mikromanipulator. Der Einspritzdruck (Pi) sollte zwischen 100 bis 200 Hektopascal (; 1 hPa ~ 0,015 psi hPa); gesetzt werden höhere Einspritzdrücke nicht verbessern Erfolgsquoten oder Qualität der Injektionen und andere Probleme mit der Mikroinjektion Pipettenspitze Größe oder DNA-Reinheit zeigen . Ein Einspritzdauer (ti) von 0,3 s und eine Entschädigung Druck (Pc) von 30 hPa, die einen konstanten positiven Druck auf die Eingabe von verschließenden Partikel aus dem Kulturmedium in die Pipettenspitze zu vermeiden liefert, verwendet werden sollte. Position des Neurons unter der Spitze der Mikroinjektion Pipette unter dem Mikroskop die xy-Achse Bühne Kontrolle injiziert werden. Richten Sie die Spitze der Pipette über der Mitte des Kerns durch die Konzentration hin und her zwischen ter Spitze und der Nucleoli. Inject den Zellkern durch Drücken der Taste spritzen (am Mikromanipulator). Für die Injektion Schritt werden die Bewegungen der Mikroinjektion Pipette und die Freisetzung von cDNA-Lösung durch den Mikromanipulator gesteuert. Es ist schwierig, erfolgreiche intranukleären Injektionen mit bloßem Auge zu bestätigen, sondern die Injektion der relativ niedrige Viskosität cDNA-Lösung (im Vergleich zu den viskosen nuklearen Umwelt), erscheint oft als ein weißer Fahne unter Phasen-Kontrast-Optik und kann als Indikator für die Injektion verwendet werden in den Zellkern. Manchmal ist die Mikroinjektion Pipette dringt nicht in die Kernmembran und einfach stupst den Zellkern. Eine zweite Injektion Versuch an der gleichen Stelle kann auf eine erfolgreiche Injektion von DNA in den Zellkern führen. Schwellung der Zelle ist in der Regel Anzeichen für unbeabsichtigte zytoplasmatische Injektion. Auch ist von Bedeutung nuklearer Schwellung nicht gut von Neuronen und führt in der Regel den Zelltod bald darauf geduldet; damit der Einspritzdruck und die Dauer nicht überschreiten sollte die vorgeschlagenen Werte. Weiter Injektion Neuronen durch Neupositionierung des Mikroskoptisches zum nächsten Neuron unter der Mikroinjektion pipet auszurichten. Systematisch durch das Gericht zu navigieren, um ca. 50-100 Kernen vor der Rückkehr der Schale von Neuronen in den Inkubator für Inkubation über Nacht zu injizieren. Erfolgreich injiziert Neuronen identifiziert den folgenden Tag durch die Expression des Reportergens werden. III. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1: Ganglion cervicale superius (SCG) Neuronen. Phasenkontrast-Bild der SCG Neuronen 3 Stunden nach der Dissoziation (A). In diesem Stadium ist der Kern deutlich sichtbar, welche Hilfsmittel Ausrichtung der Mikroinjektion Pipettenspitze. Der Kern erscheint in der Mitte von Neuronen mit einem einzigen (links) oder mehrere (rechts) dunkel Nucleoli. SCG Neuronen 16 Stunden nach der Injektion von EGFP cDNA in den Zellkern (B). Left, SCG Neuronen unter Phasenkontrast-Beleuchtung betrachtet. Richtig, epifluoreszenten Bild der gleichen Neuronen zeigen erfolgreiche Injektion und die daraus resultierenden EGFP-Expression in einem Neuron. Weiß Maßstab ist 20 um. Abbildung 2: Whole-cell-Aufnahmen von Strömen durch heterolog exprimiert G-Protein-gekoppelte einwärts gleichrichtende K + (GIRK) Kanäle von SCG Neuronen. GIRK Ströme (I GIRK) wurden von einer 200 ms Spannungsrampe von -140 bis +40 mV aus einem Betrieb von -60 mV (Einschub A) nach der Aktivierung des endogenen α 2-Adrenozeptoren durch Noradrenalin (NE, 10 uM) hervorgerufen . Überlagerte Spuren sind Aufnahmen aus dem gleichen Neuron und geben vor (schwarz) und nach Anwendung entweder NE allein (blau) oder NE plus 10 mM Ba 2 + (rot). Die gestrichelten Linien zeigen den stromlosen Ebene. Für die Aufnahme von I GIRK, die externe Lösung enthielt (in mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 10 HEPES, 10 CaCl 2, 0,8 MgCl 2, 15 Glukose, 15 Saccharose, und 0,0003 TTX, eingestellt auf pH 7,4 mit NaOH. Die interne Aufzeichnung enthielt (in mm) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 4 MgATP und 0,3 Na 2 GTP, eingestellt auf pH 7,2 mit KOH. Der Mangel an aktuellen, hervorgerufen durch die Spannung Rampe in Gegenwart von NE in injizierten SCG Neuronen (A) zeigt, dass SCG Neuronen exprimieren keine endogene GIRK Kanäle. Erfolgreiche Injektion von Plasmid-cDNA ein funktionelles GIRK Kanal 11 gibt Anlass zu großer Ströme während der Spannungsrampe wann NE (B, links) ausgesetzt. Strömungen sind die typischen Merkmale der Ströme durch GIRK Kanäle: Aktivierung durch ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Agonist (NE), nach innen Berichtigung, und Block von Strömen durch die vermeintliche GIRK-Kanal-Blocker, Ba 2 + (B, rechts rote Kurve). Offene und gefüllte Kreise vertrete ich im Betrieb und Spitzenstrom GIRK jeweils. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.