游离成年哺乳动物元DNA的细胞核内内微量注射

一，制备注射本节介绍前注射到神经元的细胞核基因需要采取的准备步骤。神经元的分离过程是超出了本文的范围，但重要的是有分离成单个细胞的神经元和坚持以及35毫米的细胞培养皿的底部表面（见讨论有用的技巧来实现这一）。虽然可能被用于各种不同的神经元，如颈上神经节（SCG）或背根神经节的外围神经节解剖的首选，因为它们方便地访问，并产生大量的神经元。使用SCG神经元的附加 ​​优点是，他们是一个人口相对同质的细胞和良好的特点是 1,2,3,4 。 A.质粒制备的cDNA注射为了防止DNA的污染或分解，必须戴上手套在准备。 克隆到一个合适的哺乳动物表达载体，如PCI（Promega公司，麦迪逊，威斯康星州）的高度和组成性激活的巨细胞病毒（CMV）启动子的调控下，DNA编码的蛋白质的利益。如果蛋白质没有标签，记者质粒编码的EGFP的pEGFP – N1，BD Biosciences公司Clontech公司，美国加州Palo Alto），例如（是合作​​注入确认成功的注入和表达。 DNA是使用高品质的分离柱（如QIAfilter的Midi – PREP试剂盒，QIAGEN，Chatsworth的，CA），并进一步纯化与PVDF过滤器（0.1微米，Millipore公司，贝德福德，马萨诸塞）使用离心式过滤装置去除微粒分离质粒的准备，它可以阻碍在注射过程中注射吸管。质粒是存储在一个约1微克/微升的浓度，在适当的DNA存储缓冲区（如TE缓冲液：10毫米，1毫米EDTA，pH值8.0的Tris）在-20 ° C。 紧接显微注射，质粒的cDNA稀释和混合，以TE缓冲液中或H 2 O所需终浓度通常情况下，10纳克/μL记者基因是足够的标签注射细胞，由于DNA在高浓度的粘性，可以堵塞注射吸管的基因注入的总浓度不得超过200毫微克/μL。准备一个基因注射体积小（5-10μL）混合溶液的滴的封口膜（纸背底侧）的一小块干净的表面上。混合溶液滴pipeting向上和向下一个pipetor几次，混合过程中，避免引入气泡。 使用microloader吸管尖（Eppendorf公司，布林克曼仪器，韦斯特伯里，纽约州），转移到专门准备的血细胞比容管（尔科技，宾夕法尼亚州匹兹堡）的cDNA解决方案。准备（材料表），血细胞比容管的说明材料。含有基因注射液1.5毫升的离心管，将血细胞比容管。 15-30分钟10 000克，在配备有一个固定角度或水平转头（Eppendorf公司）微量离心管，在室温（20-24 ° C）泥沙颗粒的cDNA的解决方案，可能会阻止显微注射吸管。的基因注射液可在室温下保存在注射会议。 B.注射液吸管的制备一次性玻璃微量注射吸管商业（如Femtotips，Eppendorf公司），这是方便，但价格昂贵（10元显微注射吸管）。可以生产注射用吸管在实验室用一个可编程的P – 97火焰山布朗吸管拉马（萨特仪器公司，诺瓦托，CA）和filamented，薄壁高硼硅玻璃毛细管（世界精密仪器，萨拉索塔，佛罗里达州）。此选项是更具成本效益和允许显微注射吸管的形状和大小的控制。 一个两阶段的计划是用来拉窄显微注射吸管提示。由于开放显微注射吸管是过于狭窄，光镜下检查，质量注射吸管直接注入少量细胞程序设置完成之前，必须加以评估。以下是热，拉，速度和时间设置的近似设置：（拉1）600，115，15，250;（拉2）640，130，65，200。这些设置随不同批次的玻璃加热丝在拉拔条件，并应根据需要进行调整。有关详细信息，请参阅5 。 拉几个（2-5）注入每盘的神经元被注入注射会议期间损坏或问题的情况下，吸管。商店在有盖容器内注入吸管，以防止灰尘进入显微注射吸管尖。 二。核内微量注射帐篷“>本节详细说明注射到神经元的细胞核基因的过程。一个基本的显微注射的设置包括一个倒置相差显微镜（如尼康Diaphot战区导弹防御系统，尼康，梅尔维尔，纽约州）可视化的过程中，显微（如5171 Eppendorf公司）控制运动注入吸管和一个高压注射器（如Eppendorf公司FemtoJet快递）开除吸管的cDNA的解决方案。，连接高压注射器的显微操纵器允许在注射后两个过程同步。可选，但强烈建议，组成部分包括一个安装视频监控系统（CCD摄像头，Cohu公司，加利福尼亚州圣迭戈;黑白视频监视器，索尼公司，东京，日本），本系统不注射的绝对要求;然而，黑色和白色的显示器，提供高对比度的提高可视化的细胞核，并提供一个更舒适的视觉体验，在长期注射会。此外，一台笔记本电脑上运行的软件操作手持式控制器可利用半注射过程自动化（见细节的讨论 ）。 注入SCG神经元的理想时间是3-6小时后离解。在这一阶段，细胞是球形的，紧紧的贴在底部的菜，是清晰可见的细胞核，相差显微镜下，作为一个中央的圆形深色膜细胞器，含有一个或多个核仁（图1A）。 游离神经元菜放在显微镜阶段的中心。调整的重点和优化相衬光学显微镜，使神经元的细胞核都清晰可见。 吸取2μL编制成的显微注射用一个microloader吸管尖吸管的cDNA溶液。避免的血细胞比容管的底部附近的绘图解决方案，因为这可能会挑起颗粒在离心落户。灯丝在显微注射吸管应援解决方案给小费，但如果坚持小气泡，轻轻一抖一侧的玻璃，赶走他们。 插入高压注射器毛细管持有人的显微注射吸管，然后安全持有人的显微。支架固定在45度角。 下入菜的显微注射吸管。吸管进入培养液，半月板的形成，影响光线的折射，降低了神经元的图像质量。为了缓解这一问题，可略有偏移的阶段环炮塔，直到神经元的细胞核都清晰可见。 一些高压喷射系统有一个“干净”的功能，适用于很短的时间内微量注射吸管尖的最高气压。使用此功能吸管开始之前和期间注射，如果提示出现堵塞的杂物清除。如果消除流体不显示在屏幕上同时使用此功能，请更换一个新的注射吸管。 中心在观看监视器的显微注射吸管和对齐旁边的一个神经细胞，并在同一焦平面核仁提示。设置此位置较低的Z轴的显微操纵器上的限制。这一立场是显微注射吸管将提前在注射的深度。您现在的位置提示这一点大约30微米以上，因此，显微注射吸管清除神经元的顶部。 “注入”的Eppendorf 5171显微操作模式可以定义以下设置执行核内注射。 注入功能设置上，而刺穿功能不放过。对角线注射路径（沿X轴和Z轴）产生量最少的细胞损伤，因此应注射使用的轴向模式。一个300微米/秒的注射速度是足够的，同步的压力上升时，显微注射吸管达到设定Z轴的限制。 高压注射器控制注射到细胞核的基因解决方案的数量。在“自动”注射模式，提供的DNA是时间控制和连接显微发起的。 注射压力 （PI）应设置100至200百帕（HPA; 1百帕〜0.015 PSI）之间;较高的注射压力不提高成功率或注射质量，并可能会指出与其他显微注射吸管针尖大小或DNA的纯度问题。 注射持续时间（TI）0.3秒和30百帕，它提供了一个恒定的正压，以避免输入的咬合到吸管尖端的培养液中的颗粒（PC）的补偿压力，应该使用。 显微注射使用显微镜的XY轴阶段控制的吸管尖下注射神经元的位置。吸管对准重点之间来回吨以上的核中心的一角他提示的核仁。 按注入按钮（显微）注入细胞核。对于注射步骤，显微注射吸管和释放的cDNA溶液的运动控制的显微操纵器。这是用肉眼难以确认成功的核内注射，但相对较低的粘度cDNA的解决方案注射液（粘性的核环境相比），往往会出现白色羽下相衬光学和可用于注射的指标进入细胞核。有时显微注射的吸管不穿透核膜，只需轻推细胞核。在同一位置第二次注射的尝试可能会导致成功进入细胞核的DNA注射。肿胀的细胞通常是无意识的细胞质注射指示的。此外，重要核肿胀是没有很好的耐受性细胞死亡的神经元和平时成绩后不久，因此，注射压力和持续时间不应超过建议值。 继续注资，通过重新定位，在显微镜阶段下显微注射吸管对齐下一个神经元的神经元。系统导航的菜约50-100细胞核注入过夜培养的神经元的菜，然后返回到孵化器。成功注入神经细胞可以识别翌日记者基因的表达。 三。代表性的成果 图1：颈上神经节（SCG）神经元 。 SCG神经元的相位对比度的图像3小时后离解（一）。在这个阶段中，细胞核清晰可见，艾滋病的显微注射吸管尖对齐。原子核出现在中心的神经元（左）单一或多个（右）暗核仁。 SCG神经元以下16个小时的EGFP基因进入细胞核（二）注射。左，SCG相衬照明下观看的神经元。右键，啶形象的成功注入，以及由此产生的一个神经EGFP的表达相同的神经细胞。 白比例尺是20微米。 图2：全细胞电流的录音通过异源表达的G蛋白偶联内向整流钾离子（GIRK）通道SCG神经元。 GIRK电流（我GIRK）诱发200 ms的斜坡电压从-60 mV的电位从-140至+40 mV的去甲肾上腺素（A的插图）以下激活内源性 α2受体（东北，10 μM） 。叠加的痕迹是由相同的神经元的录音，并指出前（黑色）和应用程序的任东北单独（蓝色）或东北加10毫米BA 2 +（红色）后。虚线表示零电流水平。 对于录音，外部溶液中（毫米）130氯化钠，5.4氯化钾，10 HEPES，10 2氯化镁， 氯化钙 ，0.8的15葡萄糖，15蔗糖，和0.0003 TTX，调整pH值用NaOH 7.4我GIRK。内部的录音解决方案中（毫米）135氯化钾，11 EGTA，1 2 2氯化钙，氯化镁2，10 HEPES，4 MgATP 和 0.3 NA 2的GTP，用KOH调节pH至7.2。 目前缺乏uninjected SCG神经元对NE引起的电压斜坡（一）演示，SCG神经元不表达内源性GIRK通道。成功的注射质粒cDNA编码功能GIRK通道11的电压斜坡上升期间，大电流时，接触到东北（B，左）。电流有电流通过GIRK通道的典型特征：活化的G蛋白偶联受体激动剂（NE），内向整流，和公认的GIRK通道阻滞剂，BA 2 +（B，正确的红色曲线）的电流块。开放和充满圆圈代表我GIRK分别控股和峰值电流。请点击这里看大图图2。