Intranuclear Microinjection من الحمض النووي في الخلايا العصبية فصل الثدييات الكبار
Summary
الحقن المباشر للintranuclear [كدنا] هو أسلوب فعال لترنسفكأيشن بعد الإنقسامية الخلايا. هذا الأسلوب يوفر مستويات عالية من بروتين تعبير مغاير من يبني [كدنا] واحدة أو متعددة ، وتمكن وظيفة البروتين لدراستها في بيئة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية مع مجموعة متنوعة من المقايسات خلية واحدة.
Abstract
الخلية العصبية الأولية الثقافات هي أدوات قيمة لدراسة وظيفة البروتين لأنها تمثل نظاما بيولوجيا أكثر أهمية بالمقارنة مع خطوط الخلايا خلده. ومع ذلك ، وطبيعة مرحلة ما بعد الإنقسامية من الخلايا العصبية الأولية يمنع فعالية بروتين تعبير مغاير باستخدام إجراءات مشتركة مثل electroporation ترنسفكأيشن كيميائيا أو بوساطة. وبالتالي ، يجب أن يوظف تقنيات أخرى من أجل التعبير عن البروتينات بشكل فعال في هذه الخلايا غير الانقسام.
في هذه المقالة ، نحن تصف الخطوات المطلوبة لتنفيذ عمليات الحقن intranuclear من يبني [كدنا] في فصل الخلايا العصبية المتعاطفة الكبار. يمكن لهذا الأسلوب ، الذي تم تطبيقه على أنواع مختلفة من الخلايا العصبية ، وتحدث بنجاح غيروي بروتين تعبير. المعدات الأساسية لهذا الإجراء يشمل microinjection مجهر مقلوب لتصور خلايا ، والماصة حقن زجاجية مملوءة بمحلول [كدنا] متصلة (أ) 2 N (ز) الضغط نظام التسليم ، وmicromanipulator ملف. وينسق الحركة micromanipulator حقن الماصة microinjection مع نبضة قصيرة من الضغط N 2 إلى إخراج حل [كدنا] من طرف الماصة.
هذا الأسلوب لا تملك سمية المرتبطة العديد من الأساليب الأخرى ويتيح ترنسفكأيشن بنيات متعددة لتكون الحمض النووي التي أعرب عنها في نسبة ثابتة. انخفاض عدد خلايا حقن يجعل الإجراء microinjection مناسبة تماما للدراسات خلية واحدة مثل التسجيلات الكهربية والتصوير الضوئي ، ولكن قد لا تكون مثالية لفحوصات البيوكيميائية التي تتطلب عددا أكبر من الخلايا وكفاءة أعلى ترنسفكأيشن. على الرغم من microinjections intranuclear تتطلب استثمارا في المعدات والوقت ، والقدرة على تحقيق مستويات عالية من بروتين تعبير مغاير في بيئة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية يجعل هذه التقنية أداة مفيدة جدا للتحقيق في وظيفة البروتين.
Protocol
Discussion
واجه المشاكل المشتركة والاقتراحات :
كما ذكر ، في وقت سابق حقن النووية الناجحة تعتمد على وجود خلايا لوحات ملتصقة زراعة الأنسجة. تأجيل بدء حقن بضع ساعات بعد إجراء تفارق الخلايا العصبية يسمح للانضمام إلى أسفل من الأطباق. بالإضافة إلى ذلك ، الأطباق طلاء بنسبة 0.1 ملغ / مل من الوزن الجزيئي عالية بولي – L – يسين (سيغما ، وسانت لويس ، MO) الإيدز التصاق الخلايا العصبية على السطح السفلي من الأطباق.
يمكن انسداد pipets microinjection ، وخصوصا عندما تحاول حقن تركيز عالية من الحمض النووي ، ومشكلة متكررة. يمكن استخدام أعمدة عالية الجودة لفصل وتنقية عزل DNA البلازميد ، وتنفيذ الخطوات الإضافية المذكورة تنقية (فلاتر تدور ، والغزل في أنابيب الهيماتوكريت) يساعد على إزالة الجسيمات قبل عن طريق الحقن. خلال الحقن ، ويمكن استخدام "نظيف" وظيفة من حاقن الضغط (ليالي 0.2 كافية) ، ولكن إذا كان هذا لا يحل المشكلة ، يجب استخدام الماصة حقن جديدة. إذا كانت غالبية pipets microinjection انسداد أثناء جلسة الحقن ، والنظر في تغيير إعدادات الزجاج مجتذب الماصة لإنتاج نصائح الماصة microinjection مع افتتاح أكبر.
والمشكلة الأخرى التي تنشأ خلال الحقن النووية هو التفاوت من السطح السفلي من الأطباق زراعة الأنسجة. هذا التغير يؤثر بشكل مباشر على دقة استهداف نصائح الماصة للحقن نواة منذ عمق ثابت يخترق الماصة خلال الحقن. لذا ، لا بد من تعديل هذا الحد ض محور أثناء الحقن داخل الطبق نفسه. وسوف يكون واضحا عند إجراء تعديل ضروري : لن يكون هناك أي مؤشر على حقن النووي (أي سحابة بيضاء في نواة أو غاب كليا الخلية) ، أو طرف الماصة حقن يقترب من قاع الطبق (ضغط الخلية تحطمها أو حتى التلميح الماصة في قاع الطبق). ويمكن استخدام الزجاج استنساخ الاسطوانات (OD 10 ملم ، القط رقم 2090-01010 ، Bellco زجاج Vineland ، ونيو جيرسي.) خلال طلاء الخلايا العصبية لحصرها في منطقة أصغر حجما وأكثر محصورة ؛ بالتالي تقليل المسافة المطلوبة للتحرك والماصة بين الحقن الحقن. تتم إزالة هذه الاسطوانات الاستنساخ قبل تنفيذ microinjections.
عيوب التقنية :
microinjections Intranuclear يطالبون تقنيا ، والتي تتطلب الصبر وعلى درجة عالية من البراعة اليدوية من قبل المشغل. الكفاءة مع هذه التقنية ، كما هو الحال مع أي مهارة أخرى ، ويأتي مع الممارسة. وهكذا ، ينصح لممارسة حقنا النووي من الجينات وحدها قبل محاولة مراسل التجارب الفعلية. لمزيد من المساعدة في عملية الحقن ، قد يكون من الممكن لترسيخ خطوات micromanipulator حاقن والضغط في برنامج الكمبيوتر. ويمكن استخدام برامج مثل ايغور برو (WaveMetrics ، بحيرة أوسويجو ، OR) لتخزين الإعدادات microinjection وبرنامج التحكم متعددة الوظائف (ShuttlePro ، كونتور تصميم ، ويندهام ، NH) إلى شبه أتمتة عملية الحقن (انظر ل6،7،8 مزيد من التفاصيل).
عيب آخر من تقنية microinjection intranuclear هي نسبة النجاح منخفضة. حوالي 10-20 ٪ من عمليات الحقن النووية حاول التعبير تؤدي إلى البروتين. هذه الكفاءة في حين قد تكون كافية للتطبيقات التي لا تحتاج إلى عدد كبير من الخلايا بالإعراب ، الكهربية على سبيل المثال ، لفحوصات البيوكيميائية المختلفة هذا قد لا يكون كافيا.
تطبيقات التقنية :
على الرغم من عيوبه ، microinjection intranuclear من الحمض النووي هو تقنية مفيدة للغاية للتعبير عن heterologously البروتينات في الخلايا العصبية.
وحققت مستويات عالية من بروتين تعبير مع microinjections النووية نظرا لوجود عدد كبير من البلازميدات تطلق في نواة خلال الحقن ، داعية نشطة للغاية CMV تنظيم النسخ الجيني ، والاستقرار طويل من البلازميدات في النواة. أكثر من التعبير عن بروتين مفيد خصوصا في التجارب السلبية السائدة التي تتطلب مستويات عالية من البروتينات مغاير لتطغى على البروتين الذاتية. ميزة أخرى لحقن intranuclear هو القدرة على تحقيق نسبة ثابت من ثوابت [كدنا] إلى النواة عندما يتم حقن بنيات متعددة. مع أساليب أخرى ترنسفكأيشن ، فمن الصعب أن أعرض بتكاثر نفس النسبة من كل بناء الحمض النووي في خلايا مختلفة في نفس الطبق وبين transfections. الحقن المباشر للحل [كدنا] في نواة يلغي هذا المصدر من مصادر التباين ويسمح titered نسبة من البروتينات وأعرب على نحو فعال.
الأساليب التقليدية ترنسفكأيشن تكون ذات فعالية محدودة في مرحلة ما بعد الإنقسامية الخلايا لأن التأسيس منخفضة من الحمض النووي في نواة (9) وسمية المواد الكيميائية المرتبطة reag ترنسفكأيشنالوالدان 10. microinjections النووية في التغلب على هذه القضايا من خلال إدخال المادة الوراثية في نواة ميكانيكيا. على الرغم من أن هذا الأسلوب هو أكثر انخراطا ، والقدرة على دراسة تأثير وجود البروتين في النظام البيولوجي الوظيفي ، مع استكمال الذاتية مسارات إشارة ، فإن أكثر من يعوض عن طبيعة شاقة من هذه التقنية.
تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات وفقا للمعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان والاستخدام.
Acknowledgements
ويدعم أبحاثنا المختبر من قبل برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة ، المعهد الوطني لتعاطي الكحول والإدمان على الكحول.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ultrafree-MC Filter Unit | Millipore | UFC30VV00 | Durapore PVDF filter; 0.1 μm pore-size | |
| TE buffer | Quality Biological, Inc | 351-010-131 | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0 | |
| Micro-hematocrit capillary tubes | Fisher Scientific | 22-362-574 | Unheparinized Preparation: Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95°C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. |
|
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417 R | With a fixed angle or swinging-bucket rotor | |
| Microloader 20 μl pipet tips | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Microinjection capillary glass | World Precision Instruments | TW120F-4 | Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | With platinum-iridium box filament (part # FB330B) | |
| Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope | Nikon | 20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table | ||
| Charge-coupled device (CCD) camera | Cohu Inc. | 6410 | ||
| Video monitor | Sony Corporation | PVM-122 | Black and White, 9” screen | |
| Micromanipulator system | Eppendorf | 5171 | ||
| Microinjection Unit | Eppendorf | FemtoJet Express | ||
| Microinjection controller | Contour Design | S-PROV2 | Programmable multimedia controller | |
| Igor Pro | WaveMetrics | Version 4.05A | Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda |
Referências
- Eccles, J. C. The action potential of the superior cervical ganglion. J Physiol. 85, 179-206 (1935).
- Ikeda, S. R. Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein βγ subunits. Nature. 380, 255-258 (1996).
- Schofield, G. G., Ikeda, S. R. Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Brain Res. 485, 205-214 (1989).
- Schofield, G. G., Ikeda, S. R. Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).
- Dean, D. A., Goldman, R. D., Spector, D. L. Chapter 4. Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. 1, 51-66 (2005).
- Ikeda, S. R. Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection. Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).
- Ikeda, S. R. Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection. Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).
- Ikeda, S. R., Jeong, S. W. Use of RGS-insensitive Gα subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons.. Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30, 606-610 (2008).
- Vivaudou, M. Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants. J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).
