由Stemgent人类TF慢病毒重新编程人类成纤维细胞生成诱导多能干细胞

1。重新编程种子北京1 × 10 5 6孔板每孔细胞密度细胞。文化在2毫升培养液（450毫升与50毫升ES合格的胎牛血清，5毫升10毫米非必需氨基酸，5 ml青霉素/链霉素，5毫升200毫米L -谷氨酰胺和0.9毫升55毫米βEMEM补充细胞β-巯基乙醇）一夜之间在37 ° C和5％的CO 2。 就在同一天，开始准备加入0.1％明胶加水稀释到6孔板和孵化一夜之间在37 ° C和5％的CO 2 MEF的接驳板。 孵化后，取出从BJ细胞的培养基，并添加2毫升6微克/毫升的聚凝胺为辅的生长介质中，500μLhOct4慢病毒，50μLhSox2的慢病毒，50μLhNanog慢病毒和50μLhLin28慢病毒，每孔。轻轻摇动，以确保中期甚至涂层板。孵育过夜，在37 ° C和5％的CO 2。 就在同一天，取出1小瓶CF – 1的MEF细胞从液氮和解冻。取出液体从明胶涂井（见步骤1.2），并添加在MEF饲养层细胞密度0.2 × 10 5细胞/孔。每孔总体积应2毫升细胞MEF生长培养基（DMEM培养液450毫升与50毫升FBS和5毫升的非必需氨基酸补充）。 次日，0.05％胰蛋白酶/ EDTA和200 XG为5分钟的离心分离与北京的细胞。吸在生长介质的介质和悬浮。删除从MEF馈线板（见第1.4步）中，加2毫升/ BJ细胞悬液。细胞浓度应约5 × 10 4细胞/孔。孵育过夜，在37 ° C和5％的CO 2。 更换与人类ES / iPS细胞培养液（100毫升淘汰赛血清替代，5毫升10毫米非必需氨基酸，5毫升200毫米L -谷氨酰胺，0.9毫升补充400毫升的DMEM/F12培养24小时后重新播种β-巯基乙醇55毫米和20 ng / ml的重组人碱性成纤维细胞生长因子）。改变介质为7天，每24小时。 七天后，改变中MEF条件培养基（见第2节）。 2。准备MEF的条件培养基种子的CF – 1 MEF饲养层细胞，2 × 10 5细胞/孔在2毫升MEF生长培养基在6孔板。孵育过夜，在37 ° C和5％的CO 2。 改变人类ES / iPS细胞培养液中的介质。孵育过夜，在37 ° C和5％的CO 2。 收集上清为4天，每24小时。通过0.22微米过滤器的过滤上清。 与碱性成纤维细胞生长因子50毫微克/毫升上清补充。 3。 IPS殖民地的选择和传代选择一个ES -殖民地在人类胚胎干/ I​​PS文化与10μMStemolecule Y27632 CF – 1 MEF饲养层细胞种子细胞培养菜培养基和重新播种。孵育过夜，在37 ° C和5的CO 2。 中期的第7天（不含Stemolecule Y27632补充），每24小时变化的文化。七天后，改变中MEF条件培养基（见准备第2条）。我们继续传代细胞，直到他们表现出典型的人类胚胎干形态。 4。多潜能性标志物的免疫细胞化学考试清洗细胞，用PBS轻轻三次。 修复细胞在室温下20分钟的固定液500μL。 清洗细胞，用PBS轻轻三次。 阻止非特异性结合，用500μl堵在室温下一个小时的缓冲。 用250μL的特定抗体，4℃过夜孵育细胞° C（我们使用1:100 TRA – 1 – 81，TRA – 1 – 60，SSEA – 4，SSEA – 3，OCT4，SOX2，Nanog和Lin28稀释）。 清洗细胞，用PBS轻轻三次。 用250μL二次抗体孵育的细胞在室温下1小时，保持避光（我们用羊抗小鼠IgM Cy3标记共轭，羊抗鼠IgG Cy3标记山羊抗大鼠IgM抗体Cy3标记共轭轭，和山羊抗兔Cy3标记物）在1:300稀释。 清洗细胞，用PBS轻轻三次。 添加的DAPI（终浓度为1微克/毫升）的最后一次洗涤，孵育5分钟，以可视化核。 分析下放大的细胞。 第5部分：代表结果 1。形态学结果： 人包皮成纤维细胞（北京）分别与Oct4的合作转，SOX2，NANOG和Lin28。早转导后第4天观察形态学变化，以及细胞集群成为更紧密的第17天（图1）包装。菌落手工采摘25天，CF – 1 MEF饲养层细胞培养。为了方便后重新编程的iPS细胞集落形成，我们使用Stemolecule Y27632岩石抑制剂，在每个通道的初始隔夜播种。三个殖民地的顺序轮采摘和传代后的iPS细胞克隆具有良好的形态观察。 2。多能性标志物的表达： 为了进一步孤立的iPS细胞集落，我们期待在ES细胞中表达的共同的全能性的标志物存在。殖民地表现出较强的碱性磷酸酶（AP）的活性（图2）。此外，免疫细胞化学（ICC）的iPS细胞克隆具有多能性的分子标记的特异性抗体的面板，包括表面标志物TRA – 1 – 81，TRA – 1 – 60，SSEA – 4和SSEA – 3以及核标记Oct4，Sox2和Nanog的。隔离IPS殖民地的所有标记（图3）呈阳性反应。国际刑事法院的结果显示，iPS细胞表现出适当的多能性标志物表达模式，表明这些iPS细胞非常类似于未分化的人类胚胎干细胞。 图1：形态学变化转BJ细胞。一个典型的iPS细胞集落形成（一）（二）4天，17天后转明场图像。 图2：AP的北京重新编程细胞的活动。三种不同的菌落染色Stemgent碱性磷酸酶染色试剂盒。 图3：人类iPS细胞表达高水平以下的ES细胞特异性标志物：表面标志物TRA – 1 – 81，TRA – 1 – 60，SSEA – 4和SSEA – 3，10月4日，NANOG和Sox2核标记。