Использование SC1 (Pluripotin) для поддержки мЭСК Самообновление в отсутствие LIF

1. Подготовка пластин MEF подачи За день до культивирования клетки ES, оттепель один флакон облученных E14.5 CF-1 MEF фидерных клеток (см. нашу процедуру о том, как оттепель ЭС клетки). Пластина питателя MEF клетки при плотности 10000 клеток / лунку в 12-луночного планшета. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С и 5% СО 2. MEF ячейки СМИ: DMEM с добавлением 10% ES-би-эс, 1X 1X глютамин и не-незаменимых аминокислот. 2. Поддержание самообновления ЭС клетках мыши Отсоедините ES клеток с использованием трипсина. Семенной клетки при плотности 50000 клеток / лунку на заранее подготовленные MEF подачи пластин в питательной среде (Knockout MEM дополнена с 15% КСР, 4 мМ L-глутамина, 0,1 ммоль без незаменимых аминокислот и 1X BME) с добавлением SC1 при требуемой концентрации (мы использовали 100 нм, 300 нм, и 1 мкМ). Мы также добавили положительный контрольный колодец, который был дополнен 1000 μ / мл LIF. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С и 5% СО 2. Культуры клеток при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 3-4 дней в каждом проходе. Обновить СМИ каждые 48 часов. Прохождение клетки 1:10 до 1:15 трипсином для поддержания одинаковой плотности, как начальная плотность посева. Через 5 пассажей, клетки могут быть проверены на предмет выражения типичных плюрипотентности маркеры, используя иммуноцитохимия. 3. Иммуноцитохимическая Экспертиза плюрипотентности Маркеры Вымойте клетки мягко три раза PBS. Fix клеток с 500 мкл фиксатором в течение 20 минут при комнатной температуре. Вымойте клетки мягко три раза PBS. Блок неспецифического связывания с 500 мкл блокирующего буфера в течение одного часа при комнатной температуре. Инкубируйте клетки с 250 мкл конкретных первичных антител (мы использовали Nanog, Sox2, SSEA1 и Oct4 на следующие разведения: 1:500, 1:2000, 1:500 и 1:500) Вымойте клетки мягко три раза PBS. Инкубируйте клетки с 250 мкл вторичными антителами в течение двух часов при комнатной температуре, держась подальше от света (мы использовали осла антимышиным сопряженных с Alexa Fluor 555 ® на 1:2000 и осла анти-кролик сопряженных с Alexa Fluor ® 488 на 1 : 2000). Вымойте клетки мягко три раза PBS. Добавить DAPI (конечная концентрация 1 мкг / мл) до последнего мыть и инкубировать 5 минут для визуализации ядер. Анализ клеток под флуоресцентным микроскопом. 4. Представитель Результаты: 1. Морфология результаты: ЭС клетки мыши (ESC R1) были выращены на MEF фидерных клеток в присутствии либо LIF или SC1 для поддержания самообновления в недифференцированное состояние. После второго прохода, дифференциации можно было наблюдать в клетках, не LIF или SC1 (отрицательный контроль) и после 5 проходов по сути, не недифференцированное колоний не наблюдалось. LIF (положительный контроль) рассматриваются колоний остались в недифференцированном состоянии на протяжении 5 проходов клетки. Клетки обрабатывали SC1 в концентрации 300 нМ или 100 нм также остается недифференцированной после 5 проходов, однако, клетки обрабатывали 1 мкМ SC1 опытных гибель клеток после четвертого прохода. (Рис 2 отметить приложение) В таблице 1 приведены морфологические наблюдения. 2. Экспрессия маркеров плюрипотентности ЭС клетки мыши поддерживается в течение 5 проходы были зафиксированы и рассмотрены иммуноцитохимии для SSEA1, Oct4, Nanog и Sox2. Маркер выражении был похож на клетки сохраняются в LIF. (Рис. 3 и 4 записки приложение) Рисунок 1: Морфология сравнению клеток поддерживается в LIF или SC1. Никаких различий в морфологии не наблюдалось. Рисунок 2 и Рисунок 3: Nanog, SSEA1, Sox2, и Oct4 окрашивания ЭС клеток поддерживается с SC1 или LIF (рис. 4 записки приложение). Клетки поддерживается в SC1 показывают, что аналогичные выражения плюрипотентности маркер для клеток поддерживается в LIF. Таблица 1 Отрицательный контроль LIF Положительный контроль SC1 1 мкм SC1 300 нМ SC1 100 нМ Прохождение первого Нормальная морфология ячейки ES Нормальная морфология ячейки ES Нормальная морфология ячейки ES Нормальная морфология ячейки ES Нормальная морфология ячейки ES Второй проход Некоторые дифференцированной морфологии Нормальная ES морфологии клеток Нормальная морфология ячейки ES Нормальная морфология ячейки ES Нормальная морфология ячейки ES Третий Прохождение Большинство клеток дифференцированных Нормальная морфология ячейки ES Нормальная морфология ячейки ES Нормальная морфология ячейки ES Нормальная морфология ячейки ES Четвёртое Прохождение Нет ESC колонии Нормальная морфология ячейки ES Гибель клеток наблюдается Нормальная морфология ячейки ES Нормальная морфология ячейки ES Прохождение пятой дифференцированный Нормальная морфология ячейки ES Гибель клеток наблюдается Нормальная морфология ячейки ES Нормальная морфология ячейки ES