Antikor Profil Lusiferaz Immunoprecipitation Sistemleri (LIPS)

1. Şematik Bakış: Bu video LIPS tahlil yer alan adımları gösteriyor. Antijenler rekombinant Renilla lusiferaz (Ruc) antijen füzyonlar ve özütleri gibi Cos1 hücre olarak ifade edilen ve arıtma olmadan kullanılamaz. LIPS testi rezil e Ruc antijen özleri mikrotiter kuyuları hasta serumu ile inkübe edilmesiyle başlatılır. Antikor-antijen karışımı daha sonra IgG moleküllerinin yakalamak için protein, A / G boncuklar içeren 96-iyi filtre plakasına aktarılır. Protein içeren filtre plaka yıkadıktan sonra Ruc antijen coelenterazine substrat ilavesi ve ışık birimleri ile ölçülür bağlı A / G boncuk, antikor lüminometre ile ölçülür. BÖLÜM 1: Renilla Antijen Fusion Proteinler üretimi için Plazmidler Transfeksiyon Set-up: Cos1 hücrelerin doku kültürü standart protokolleri kullanarak DMEM-10% FCS kültür. Plazmidler Renilla lusiferaz füzyonlar için daha önce 1 tarif edilmiştir. Bu plazmid DNA Qiagen bir Midiprep kiti kullanılarak hazırlanmıştır. Verimi yaklaşık 1 -3 mg olmalıdır. -20 ° C'de 1000 mcg / ml stok solüsyonu olarak DNA konsantrasyonu ve mağaza ölçün Prosedür: Bir gün önce transfeksiyon, split Cos-1 hücreleri içine yeni bir 100 37 plaka ve inkübe başına yaklaşık 2 x 10 6 x 20 mm yemekleri ° C Ertesi gün, Cos-1 hücreleri,% 80-95 konfluent olmalıdır. Her plazmid DNA Etiket 1.5 ml polipropilen mikrofuge'de tüpler transfekte. 4 saklanan FuGENE-6 transfeksiyon reaktif ° C, oda sıcaklığında ısınmak için izin verin. Opti-MEM medya 94 ul her mikrofuge'de tüp ekleyin. Daha sonra yan duvar dokunmadan FuGENE 6 6 ul Opti-MEM medya ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Plazmid Renilla lusiferaz antijen füzyon için 1-2 mg (1mg/ml DNA stok) inşa ettiniz. Karıştırın ve sonra karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. DNA FuGENE 6-Opti-MEM çözüm Cos1 hücrelerinin ortama eşit damlama hücrelere aktarın. BÖLÜM 2: Hasat Renilla antijen Fusions Transfeksiyon İki gün sonra, Cos-1 hücreleri hasat edilir. Bu medya kaldırılması ve daha sonra 6 ml PBS ile hücreleri durulama tarafından başlatılır. PBS şişeden sonra, doku kültürü çanak herhangi bir kalıntı PBS uzak pipetle. Soğuk lizis tamponu 1.4 ml 50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2,% 1 Triton X-100,% 50 gliserol ve proteaz inhibitörleri (50 ml başına tam miniprotease inhibitörü kokteyl 2 tablet oluşan ekle lizis tamponu). Bir hücre dozajlama ile Hasat hücreleri ve hızlı bir şekilde buz üzerinde iki adet 1,5 ml mikrofuge'de tüplerin her lizat yarısı transfer. Branson Sonifier 150 hücrelerin açık kırmak için kullanılır. Sırasıyla 2, 2 ve 4 sonication ayarları, 5 sn, 5 sn ve 5 saniye için buz ve darbe hücre lizat içeren mikrosantrifüj tüp yerleştirin. Ilk spin sonra, tüp yanağında hafifçe gevşek bağlı enkaz kaldırmak için tüpler ters, 4 az iki 4 dakika spin ° C için 12.500 RPM hücre lizat santrifüjleyin. Ikinci spin sonra, buz üzerinde yeni bir mikrofuge'de boru iki tüp, pelet bozmadan, supernatant dikkatli bir şekilde aktarmak. Lizat, ul başına ışık birimi (LU) hesaplayın. LU ölçmek için yeni bir mikrofuge'de boru 8 ul PBS ile 1 ul lizat sulandırmak. Doğrudan 1X coelenterazine substrat 100 ul seyreltilmiş karışımı ekleyin ve 5 saniyede bir okuma, bir tüp luminometre (20/20 n Tuna Bilimsel) kullanarak tüp hemen lüminesans ölçmek. -80 Alikotları kez daha uzun süre 1-2 gün ya da saklamak için -20 ° C'de Ruc antijen lizat Mağaza ° C. BÖLÜM 3: Sera Master Plaka hazırlanması Ilk A (50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2,% 1 Triton X-100) 96-derin kuyu polipropilen mikrotiter plate her bir kuyunun 450 ul tampon ekleyerek bir sera ana plaka olun . Bu aşamada, boya, Fenol Kırmızı, aynı zamanda bir gelecekte sera örnek toplama ve LIPS testinin diğer adımları izlenmesi için bir izleme olarak hareket etmek (son konsantrasyon Tampon 0.2 mikrogram / ml 'dir) tampon dahil olabilir. Sonraki tampon A. 450 ul içeren farklı bir kuyu için her örnekten 50 ul sera eklemek Genelde sera ana plakasının son iki kuyu değildir tampon A. sera 1:10 seyreltme Not nedeniyle Bu tampon boşlukları için ayrılmıştır. Ana plaka kullanmadan önce, kapsamlı bir rotator platform üzerinde (1-2 saat) çalkalanır. Ana plaka serum stabuharlaşmasını önlemek için doğru saklanan 4 ° C, en az 1 ay veya daha uzun ble. Aşağıda açıklandığı gibi, bu ana plaka 10 ul art arda birden fazla antijene karşı sera profili çıkarılmalıdır seyreltilmiş sera sağlar. Büyük ve küçük ana plakaları da istihdam edilecek. Seal kullanılan Parafilm plaka. BÖLÜM 4: LIPS tahlil Polipropilen 96-sığ kuyu microtiter plakalar sera test etmek için kullanılır. İlk adımda, her kuyuya, 8 kanal mikropipet kullanarak 96-plaka 40 ul tampon bir ekleyin. Sonraki 10 ul ana plaka seyreltilmiş sera (1 ul sera eşdeğeri) ve 8 kanal mikropipet kullanarak çalışma plakasının her bir kuyunun doğrudan ekleyin. Ruc antijen ekstresi içeren bir master miks sonraki 1 X 10 7 ışık birimi (LU) her bir kuyunun 50 ul tampon eklenen olduğu gibi formüle edilmiştir. Alt girişler (olduğunca az X 10 6 1 olarak) kullanılır, ama daha düşük bir dinamik aralık sonucu olabilir. Her bir kuyu için bu ana karışım ve pipet 50 ul Ruc antijen karışımı olun. Döner çalkalayıcı plaka oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. İnkübasyon sırasında, yeni bir 96 filtre HTS plaka (Millipore, Bedford, MA) her bir kuyunun dibine ULTRALINK protein PBS A / G boncuk (Pierce Biyoteknoloji, Rockford, IL)% 30 süspansiyon 5 ul eklemek . 1 saat inkübasyondan sonra, protein, 8 kanal mikropipet kullanarak A / G boncuklar içeren 96 filtre HTS plakaları 100 ul Ruc antijen antikor reaksiyonu karışımı aktarın. Oda sıcaklığında 1 saat için 96-iyi filtre plaka döner çalkalayıcı inkübe edin. Sonra, bir vakum manifoldunun üzerine filtre plaka yıkayın. Her iyi 100 ul PBS ile iki kez, Tampon A 100 ul 8 kez yıkanır. Bu elle veya bir robot pipetleme iş istasyonu ile yapılabilir. Son yıkama sonrasında, vakum kapatılır. Filtre plaka çıkarın ve bir yığın kağıt havlu ya da plakanın üst ve alt kısmında nem kaldırmak için emin olmak için filtre kağıdı kullanılarak kuru kurulayın. BÖLÜM 5: Ölçme Lüminesans ve veri analizi Set-up: Berthold LB 960 Centro mikroplaka luminometre her iyi tek bir enjektör kullanarak lüminesans belirlemek için kullanılır. Makinede sonra, distile H 2 O enjektör, enjektör yıkama döngüsü kullanarak yıkayın . Coelenterazine yüzey üretici tarafından açıklandığı gibi Promega Renilla substrat kiti kullanılarak hazırlanmıştır. Genellikle 6 ml 1X coelenterazine substrat karışımı (yani 60 ul coelenterazine stoku artı tampon 6 ml 1X) emişli makine için hazırlanmış ve tam bir 96-plaka çalışıyor. Plaka analiz etmeden önce, Berthold LB 960 Centro mikroplaka luminometre 1X coelenterazine substrat ile astarlanmalıdır. Yüzey enjekte ve plaka okuma için ayar içeren bir program dosyasını açın. Bu ölçümler için, 50 ul coelenterazine substrat enjekte edilir, plaka lüminesans okuma 5 sn 2 sn, çalkalanır. Plaka luminometre tüm plaka okuma kapasitesine sahip olmasına rağmen, kısmi bir plaka okuma de seçilir (okuma menüsü altında) olabilir. Programı, plaka okuma başlatır başlayın. Çalıştırdıktan sonra, luminometreye dökülmesini önlemek için derhal mikrotiter filtre plaka kaldırın. İhracat, analizi için Excel formatında içine MikroWin programı ile oluşturulan veri. Biz iki bağımsız çalışır sera değerlendirilmesi önerilir. Veri daha sonra her bir örnek için LU titresi değerleri üretmek için ortalama olarak. Bu değerleri daha fazla tampon boşlukları çıkarmak için ayarlanabilir. Ek veri analizi, kesme, ortalama 3 ya da 5 artı kontrol değerleri standart sapmaları alınarak hesaplanır belirleyen gibi.