단백 분해 효소의 활동을 확인하는 프로 테아제 형광 검출 키트의 사용

준비 지침 부화 버퍼, 버퍼 분석 및 0.6 N TCA 솔루션은 즉시 사용 솔루션으로 제공합니다. FITC – 카제인 기판은 – 그것은 반복 동결 – 해동주기를 피하기 위해 도착시 작은 볼륨으로 나누어지는 FITC – 카제인 기판을하는 것이 좋습니다. FITC – 카제인 기판이 반복 동결 – 해동주기를 받게되면, 백그라운드에서 약간 증가 감도를 낮추함으로써, 발생합니다. aliquots는 -20 ° C에 보관하고 빛으로부터 보호되어야합니다. 각 예제는, 공백, 또는 제어 반응은 FITC – 카제인 기판 20 μl가 필요합니다. 해동뿐만 아니라 활발한 혼합 또는 흔들림하면 FITC는 읽기와 더 적은 기판은 프로 테아제의 절단에 사용할 수로 인해 높은 배경에 발생하는 카제인에서 분리가 발생할 수 있습니다 / 프리즈. 플루오레신 isothiocyanate (FITC) 제어 솔루션 FITC 컨트롤을 적절한 농도로 분석 버퍼에 재구성 수 있습니다. 이 솔루션은 신선했고 빛으로부터 보호되어야합니다. 최종 트립신 제어 솔루션 – 트립신, 프로 테아제 제어 (제품 코드 T 6567)의 약병 1 MM HCL 100 μl를 추가합니다. 트립신이 해소되도록 간략하게 섞는다. 부화 버퍼 900 μl를 추가하고 잘 섞는다. 분석을 위해 필요한 경우 또는, 다른 버퍼를 사용할 수 있습니다. 트립신의 마지막 작업 농도는 20 μg / μl입니다. 때 트립신 제어 솔루션을 준비하는 준비 부화 버퍼 (9 부품 버퍼 1 부분 산성의 트립신)의 정확한 금액과 산성 트립신 솔루션의 나누어지는을 결합. 산성 조건 하에서 트립신을 저장하면 트립신의 안정성을 증가시킵니다. 트립신 제어 솔루션은 온도에 민감한하고 낮은 농도에서 안정되지 않습니다. 스토리지 및 이러한 준비 솔루션의 안정성을위한 키트의 기술 게시판을 참조하시기 바랍니다. 절차 한 번에 모든 컨트롤, 공백, 그리고 샘플을 준비하는 가장 쉬운 그것을 것입니다. 각 테스트 샘플의 경우, microcentrifuge 관을 배양 버퍼 20 μl, FITC – 카제인 기판 20 μl 및 테스트 샘플의 10 μl를 추가합니다. 높은 단백 ​​분해 효소 활동과 테스트 샘플, 샘플 희석이 필요할 수 있습니다. microcentrifuge 관을 배양 버퍼, FITC – 카제인 기판 20 μl 및 제어 샘플 10 μl 20 μl를 추가하여 적절한 컨트롤 샘플 (컨트롤 샘플을 참조) 준비합니다. microcentrifuge 관을 배양 버퍼, FITC – 카제인 기판 20 μl, 그리고 ultrapure 물 10 μl 20 μl를 추가하여 빈 샘플을 준비합니다. 부드럽게 37 60 분 어둠 속에 ° C에서 각각의 튜브와 부화를 섞는다. 과도한 난류가 높은 형광 배경을 일으킬 수 있으므로, 너무 적극적으로 믹스 및 분석의 감도를 감소하지 않도록주의하십시오. 참고 : 배양 시간이 감도를 높이기 위해 최대 24 시간까지 연장할 수 있습니다. 높은 형광 배경에 이르는, FITC – 카제인이 저하될 시작 수 있으므로 24 시간 초과하지 않도록주의하십시오. 부화 후 각 microcentrifuge 관에 0.6 N Trichloroacetic 산성 솔루션 150 μl를 추가합니다. TCA는 매우 부식성이고 적절한 보호 장비를 착용하는 동안 처리한다. 부드럽게 37 믹스와 부화 ° 30 분 동안 어둠 속에 C. 10,000 X G. 10 분 동안 튜브를 원심 분리기 뜨는은 염산 가용성, FITC 레이블 조각을 포함하고 형광 측정을 위해 사용됩니다. 형광 측정 이 방법은 최대 크기를 조절하거나 아래로 사용할 수있는 장비의 요구 사항에 따라 수 있습니다. 해당 컨트롤 샘플 준비 표준 곡선을 비교, 각 테스트 샘플의 값 (FLUtest)에서 빈 샘플 (FLUblank)의 형광 읽는 뺍니다. Cuvettes 피펫 10 뜨는 (7 단계)와 적당한 쿠베트로 분석 완충액 1 ML의 μl 부드럽게 섞는다. 참고 : 최대 24 시간이 형광을 측정하기 전에를위한 뜨는 및 어세이 버퍼의 솔루션은 2-8 ° C에서 어둠에 저장되어있을 수 있습니다. 485 NM에서 여기로 형광 강도를 기록하고 535 nm의의 방출 파장을 모니터링. Multiwell 플레이트 뜨는 (7 단계)와 적합한 튜브 또는 유리병에 분석 완충액 1 ML 부드럽게 혼합 참고 피펫 10 μl : 뜨는 및 어세이 버퍼의 솔루션은 최대 2-8 ° C에서 어둠에 저장되어있을 수 있습니다 형광을 측정하기 전에 24 시간. 블랙 96 잘 접시의 잘 200 μl를 전송합니다. 485 NM에서 여기로 형광 강도를 기록하고 535 nm의의 방출 파장을 모니터링. 또는 피펫 뜨는 2 μl (7 단계) 및 분석 B 200 μl블랙 96 잘 접시의 우물에 uffer. 참고 : 최대 24 시간이 형광을 측정하기 전에를위한 뜨는 및 어세이 버퍼의 솔루션은 2-8 ° C에서 어둠에 저장되어있을 수 있습니다. 485 NM에서 여기로 형광 강도를 기록하고 535 nm의의 방출 파장을 모니터링. 컨트롤 샘플 트립신 제어 솔루션은 분석은 검출 한계를 결정하거나, 일반적인 표준 곡선을 만들려면 제대로 실적을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 다른 특정 프로 테아제의 분석을 위해, 그것은 적절한 배양 버퍼에 특정 프로 테아제를 포함하는 제어 솔루션을 준비하는 것이 좋습니다. 분석의 검출 한계는 빈 샘플과 획득의 가치 위에 상당한 형광 독서를 생산 테아제의 금액입니다. 검색의 제한은 장비의 감도에 따라 달라집니다. 트립신 제어 솔루션의 직렬 dilutions는 컨트롤 솔루션을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 빈 샘플 얻은 값을 120 %로 읽는 동일가 중요한 것으로 간주됩니다. 일상적으로, 트립신 5 NG의 감지 한계는이 절차를 얻은 것입니다. 이것은 하나 이상의 다섯 NG 트립신 컨트롤이 각각의 분석으로 실행하는 것이 좋습니다. 0.5 μg / ML의 농도와 트립신 제어 솔루션은 분석에서 트립신의 원하는 5 NG가 발생할 것입니다. 트립신 제어 솔루션 (20 μg / ML) 0.5 μg / ML 제어 솔루션, 인큐베이션 버퍼 39 부분 트립신 제어 솔루션 즉, 한 부분의 결과를 40 배 희석. 그림 1 (트립신 활동의 표준 곡선) : 트립신 제어 솔루션 (20 μg / ML)도 (그림 1 참조) 시리얼 dilutions함으로써 표준 곡선을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 각 컨트롤 샘플의 형광 읽기는 각 컨트롤 샘플 (FLUcontrol)의 가치에서 빈 샘플의 형광 읽기 (FLUblank)를 빼서에 의해 수정되었습니다. 이 키트 및 0.15 μg / ML (1.5 NG)에서 2.5 μg / ML (25 NG)에 이르기까지 컨트롤 샘플을 사용하여 트립신 (제품 번호 T 6567)에 대한 전형적인 표준 곡선. 이 곡선은 4 단계 30 분 배양 시간, 설명 절차에 따라 생성되었습니다. 형광 측정은 multiwell 접시에서 만들어졌다. 플루오레신 isothiocyanate가 가능한 계측기 교정에 대한 제어 (해당 제조 업체의 지침을 참조) 또는 FITC 신호의 선형성 범위의 결정으로 제공됩니다.