Teil 1: Alexa 594 Labeled Embryos 1,1 Mikroinjektion Plate und Needle Vorbereitung Machen Mikroinjektion Platten Bereiten Injektion Platten drei vor fünf 1-mm Tröge besteht in einer Agarose-Form mit Hilfe einer Technik, die von Westerfield, 2007 1. Diese Rinnen werden snuggly halten die Embryonen in einer Zeile für eine effiziente und systematische microinjections. Vor der Gewährung der Platten, nehmen Sie drei 1-mm, 4-Zoll lang non-Filament-Kapillaren und sorgfältig brechen sie in zwei Hälften. Mit Sekundenkleber, Kleber zwei dieser 2-Zoll langen Kapillaren side-by-side auf einer ebenen Fläche. Kleben Sie die dritte auf der Oberseite der beiden, in den Hain gelegen Kapillare, die Schaffung eines Pyramidenform mit den drei Kapillaren. Trocknen lassen und wiederholen, bis genug "Wanne Formen" konstruiert werden. Gießen Sie 20-25ml (5mm Tiefe) aus geschmolzenem 1,5% Agarose in Embryo-Medium (EM) [5 mM NaCl, 0,17 mm KCl, 0,33 mm CaCl 2, 0,33 mm MgSO 4 und 0,00003% Methylenblau] in eine 100mm Petrischale. Unmittelbar Platz drei vor fünf der bisherigen pyramidenförmige Mulde formen an der Unterseite der Platte Gewährleistung der flachen Seite der Form berührt den Boden der Petrischale und vollständig durch Agarose abgedeckt. Wenn die Agarose erstarrt ist, muss der Glaskapillare Formen entnommen werden. So entfernen Sie, cut out eine große Agarose Quadrat mit den drei Kapillare Formen. Vorsichtig lösen die Agar an der Peripherie des geschnitten und zu verwerfen. Flip the square Agar Stück über und mit feinen Pinzetten, vollständig zu entfernen den Trog Formen. Gießen geschmolzene Agarose in die Petrischale rund um den Platz an der neu geformten Brunnen in Position zu halten. Lassen gesetzt. Die Platten können Parafilm verschlossen und für Wochen Lagerung bei 4 ° C betragen Entsorgen Sie bei Anzeichen von Wachstum in den Agar. Nadeln für die Mikroinjektion. Verwenden Sie eine Mikropipette Kapillare puller die notwendigen Injektionsnadeln von 1-mm, 4-Zoll-Glaskapillaren mit internen Filament. Needles gezogen wurden unter Verwendung der Flamming / Brown Mikropipette Puller mit einer Hitze von 550, Zugkraft von 120, Geschwindigkeit von 200 und eine Zeit / Verzögerung von 200. 1,2 Gewinnung und Mikroinjektion Geräte-Setup Befruchteten Eier werden sofort erhoben, nachdem sie gelegt und in eine Petrischale mit EM gefüllt gehalten. Die Injektion von fluoreszierenden Dextrane ist ideal bei der Ein-Zell-Stadium und sollte von der 16-Zell-Stadium 2 abzuschließen. Mit einer breiten Spitze Glaspipette, vertreiben Embryonen in die Vertiefungen einer Raumtemperatur Injektion Platte mit EM gefüllt. Gently Keil die Embryonen in die Unterseite der Tröge mit gefalteten stumpfen Pinzette. Embryonen, deren Chorion oder Eigelb manipuliert wurden, muss verworfen werden. Laden Sie die Injektionsnadel mit 1-2μl des verwässerten fluoreszierenden Alexa 594-Lösung (5 Gew.% in 0,2 M KCl). Lassen Sie die Dextran an die Spitze der Injektionsnadel durch Kapillarwirkung durch die eingebetteten Faden über die gesamte Länge der Injektionsnadel zu reisen. Bringen Sie die Injektionsnadel in die Kapillare Inhaber eines stereotaktischen Mikromanipulator. Passen Sie den Druck auf die Mikroinjektor Apparat mit 40-50 Psi und Pulsdauer von 500 ms beginnen. Gently grasen die Spitze der Injektionsnadel, um die Dichtung mit einer Pinzette (ideal Durchmesser 0,05-0.15mm) zu brechen. Mit einem steromicroscope, vertreiben die Dextran auf einen Mikrometer mit Mineralöl oben auf der es um die Nadel zu kalibrieren. Ändern Sie den Bolus-Größe durch die Anpassung des Luftdrucks, die Dauer des Pulses und der Größe der Nadelspitze. Ein Bolus Größe entspricht einem Volumen von 0,8-1NL sollte während Injektionen 3 gehalten werden. Oft Tipps mit Eigelb Partikel verstopft werden; Einstellung des Drucks oder Brechen der Nadelspitze kann das Problem lindern, sonst eine neue Injektionsnadel muss geladen werden. 1,3 Mikroinjektionen von Fluorescent Alexa 594 Unter starker Vergrößerung, beginnend von einem Ende des Troges, glatt durchstoßen die Chorion und Zellmembran von Embryonen in die Eigelb geben. Spritzen Sie die Dextranlösung knapp die Zelle. Achten Sie darauf, die Injektionsnadel mit dem gleichen glatten Bewegung verwendet werden, um den Embryo geben zu entfernen. Bewegen Sie die Petrischale auf die nächste Embryo Inline-Position und weiter Injektion über die gesamte Länge des Troges. Überprüfen Sie den Druck und die Bolus-Größe in regelmäßigen Abständen. Achten Sie darauf, sich nicht zu bewegen und biegen Sie die Injektionsnadel, wenn es in den Embryo als dies wahrscheinlich tödlich Schäden des Embryos und / oder brechen die Injektionsnadel. Schieben Sie die Embryonen aus den Trögen mit einer Pinzette. Übertragen Sie sie auf einer Petrischale mit einer Antibiotika-Pen gefüllt / Step EM in Nüsslein-Volhard und Dahm (2002) (1ml 6.5M CaCl 2, 1 ml 3,5 M NaHCO 3, 25ml und 10ml 20x EM von 60mg/ml Penicillin, 100 mg / beschrieben ml Streptomycin stock) in Vorbereitung für spätere Transplantationen. Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 ° C und Monitor für unbefruchtete Eier oder Embryos Tod. Teil 2: Gastrulastadium Transplantationen 2,1 Dechorionating und Transplantationschirurgie Platte Vorbereitung Dechorionating Platten. Dechorionated Embryonen, die nicht abgeschlossen haben epiboly benötigen eine weiche Bodenplatte, um nicht ihre Eigelb haften und Verschleiß an der plastic.The Tag vor der Transplantation mit den 1,5% igen Lösung zuvor beschrieben, machen dechorionating Platten durch Ausgießen 5 -10 ml geschmolzener Agarose in ein 100mm Petrischale. Nur eine dünne Schicht aus Agarose (2-3mm) wird benötigt, um die Embryonen während dechorination Kissen. Abkühlen lassen. Transplant-Platten. Specialized Platten mit getrennten Brunnen müssen gemacht wie in 4 beschrieben werden. Gießen Sie 30ml der 1,5% igen Lösung in einen 100 mm Petrischale und legen Sie eine Transplantation auch Schimmel. Die Form sollte 104 dreieckige Einschläge jeder der drei 90-Grad-Seiten umfasst und eine 45-Grad-Winkel seitlich. Die Brunnen sind so konzipiert, zwei Embryonen side-by-side (Abb. 1A, lila Kasten) zu halten. Achten Sie darauf, um Luftblasen unter der Form Falle. Lassen Sie die Agarose verhärten. Entfernen der Form zeigt eine versunkene Gegend mit den quadratischen Wells mit einer geneigten Rand. 2,2 Embryo-und Transplantationschirurgie Geräte-Setup Positionierung von Donor-und Host-Embryonen Entwicklung von Hosts und Geber müssen überwacht werden, um in der Nähe gleichaltrigen Paarungen zu erhalten. Um dies zu tun, können Embryonen bei unterschiedlichen Temperaturen (25-31 ° C) angehoben werden, um zu verlangsamen oder beschleunigen die Entwicklung bzw.. Beide Gastgeber und Spender Embryonen sollten Hand auf einem Agar-beschichteten dechorionating Platte 1 Stunde vor dem gewünschten Alter Bei Gastrulastadium Transplantationen dieses Bedürfnis, indem 5hpf abgeschlossen sein würde dechorionated werden. Vor der Bühne Schild, auf 5.5hpf Gastgeber und Spender Embryonen werden in einer Transplantation Platte mit Antibiotikum EM gefüllt geladen. Die Embryonen werden in die einzelnen 1-mm Bohrungen mit einer Glaspipette geladen. Ein Beispiel hierfür ist wie folgt: Die erste Reihe ist mit Spender Embryonen gefüllt (18 insgesamt, zwei Embryonen pro Well) und die beiden folgenden Zeilen werden mit Host-Embryonen gefüllt (ein Embryo pro Well, 9 Embryonen pro Zeile). Einrichten der Transplantation Apparat Transplantationen sind auf der Zeiss Lumar fluoreszierenden Stereo-Mikroskop, das vollautomatische, Joystick gesteuert Zoom und Fokus Manipulation durchgeführt hat. Während Transplantationen ohne diese Automatisierung des Mikroskops getan werden kann, es drastisch erhöhen Leichtigkeit und Effizienz vor allem, wenn eine hohe Anzahl von Transplantationen gewünscht wird. Stellen Sie die Eppendorf Airtram zur Mitte Lage ihres Umfangs. Schließen Sie die Airtram (Abb. 1A, roter Kasten) Schlauch an den Kapillar-Halter, und befestigen Sie die Halterung an der Eppendorf automatisierte Mikromanipulator (Abb. 1A). Dieser Mikromanipulator ist voll automatisiert und Joystick gesteuert. Auch hier ist diese Automatisierung nicht ganz notwendig, aber deutlich verbessert eine Fähigkeit, die Nadel herum und in den Embryo zu navigieren. Alternativ können, bevorzugen viele Forscher die OilTram, die angeblich weichere Steuerung von Zell-Sammlung anbieten wird, aber wir hatten keine Schwierigkeiten mit der Airtram. Die Kapillaren verwendet wurden sterile Eppendorf TransferTips (ES), dass ein 15 m abgeschrägte Öffnung an der Spitze und einem 20-Grad-Winkel gebogen 1mm von der Spitze (Abb. 1A green box) haben. 2,3 Gastrulastadium Zelltransplantaten Am 6hpf, mit dem Mikromanipulator leicht grasen den Embryo mit der Spitze der Kapillare auf den Embryo in Position für die Zell-Extraktionen, dass seine Mittellinie und Schild sichtbar und gegen die Spitze der Kapillare sind zu drehen. Saugen Sie eine kleine Menge von EM in die Kapillare eine Chance von Zellen Kontakt mit der Luft-Wasser-Grenzfläche, die die Zellen schädigen würde verhindern. Basierend auf den Zebrafisch Schicksal Karte, Targeting Zellen im Vorderhirn erfordert die Transplantation von Zellen an der Mittellinie genau zwischen den animalen Pol und die Abschirmung 5. Vorsichtig durchstoßen Ektoderm Spender Embryonen (Rhodamine gespritzt oder GFP transgenen Embryos) in dieser Position. Die Dicke der Zellen, die zwischen dem Ektoderm und der zugrunde liegenden Dotter in der Gastrula ist dünn, daher seien Sie vorsichtig, nicht zu dem Eigelb aufspießen, da dies oft zum Tode führen innerhalb von Stunden. Mit dem Airtram absaugen Zellen langsam in die Kapillare. Halten Sie immer die Sichtbarkeit der Wasserlinie. Leichte Bewegung der Spitze, während in den Spender wird dazu beitragen, Zell-Zell-Kontakte zu verlieren. Etwa 10-50 Zellen vom Spender Embryo sollten abgesaugt werden, bevor sie aus dem Embryo entfernt wird. Entfernen Sie die Kapillare aus dem Spender, ähnlich Ausrichtung der Gastgeber, und durchbohren und vertreiben die Zellen in die exakte samir Lage zwischen den animalen Pol und Schild von Host-Embryonen. Nach der Transplantation werden die Spender und Wirt Embryonen aus den Vertiefungen entfernt, getrennt und vorsichtig auf eine Agar-beschichteten Petrischale mit Antibiotika EM gefüllt ist. Verlassen Embryonen in der Transplantation Brunnen steigt die Sterblichkeit. Inkubieren Embryonen bei 28,5 ° C. 2,4 Visualisieren und Imaging Embryos Montage feste und Live-Embryonen. Host-Embryonen aus transgenen GFP oder Rhodamin injizierten Embryonen gewonnen werden können visualisiert und lebendig abgebildet oder als feste Embryonen. Wir stellen Ihnen hier Beispiele für Fest-und Live-Imaging-Optionen. Fix Embryonen wurden bei 30hpf geopfert mit 4% paraformadehyde in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) über Nacht bei 4 C 1. Spülen Embryonen 2x und dann waschen 3 x 5 Minuten in 0,1 M PB. Im Beispiel bieten wir waren fest Gastgeber für alle Axone mit Antikörpern gegen acetylierte Tubulin (α-AT) wie zuvor beschrieben 6 gerichtet immunolabeled. Legen Embryonen in 75% Glycerin, bei Raumtemperatur sinken und dann bei 4 ° C. Bereiten Sie eine Folie an zwei Embryonen zu montieren. Erstellen Sie zwei Vaseline quadratischen Konturen auf einer Folie, die das Innere Form und Durchmesser eines Quadrats Deckglas übereinstimmen. Deyolk ein Embryo und eine Frontalansicht des Vorderhirns, sezieren Sie das Vorderhirn, indem senkrecht über dem Mittelhirn. Legen Sie dieses Gewebe mit einer minimalen Menge von Glycerin in der Erdöl-und. Orient das Gewebe in die entsprechende Position und legen ein Deckglas über die Probe. Live-Proben wurden in einer 0,75% igen Lösung bestehend aus einem 4% igen Lösung von Tricaine (in EM) auf Glasboden Kulturschalen montiert. Vor der Agarose verfestigt, wird der Embryo mit einer Wolfram-Nadel richtig orientieren sie für die Bildgebung manipuliert. Für unsere Analyse haben wir orientierten Vorderhirn direkt gegen das Deckglas. Imaging Sowohl Festnetz-und Live-Gastgeber waren abgebildet mit der Leica SP5 Laser Scanning konfokalen Mikroskops. Z-Stacks wurden erworben und 3 – oder 4-dimensionalen Bildverarbeitung wurde unter Verwendung Volocity Software. Ergebnisse: In dem Bemühen, die Rolle der Astrozyten im Vorderhirn-Adresse ist es notwendig, sowohl visualisieren diese Zellen und zielen auf unterschiedliche genetische Manipulationen an kleinen Clustern von Zwischenhirn und telencephalic Zellen. Zur Erzeugung dieser Art von chimären Embryonen, bei denen ein Teil der astroglialen Bevölkerung innerhalb der Embryo ist unterschiedlich, ob durch Genotyps oder Phänotyps wir einen mehrdimensionalen Ansatz, dass die Verwendung von GFP transgenen Embryos, die Astroglia Etiketten kombiniert verwendet, mit dem Einsatz von Gastrula inszenierte Stammzelltransplantation. Um gezielt unsere Klone des Zwischenhirns, verwendeten wir den Zebrafisch Gastrula Schicksal Karte, um selektiv extrahieren Zellen an der Mittellinie gleich weit entfernt von den animalen Pol und das Schild 5 (Abb. 1B). Diese extrahierten tg [GFAP: gfp] Zellen wurden dann in die gleiche Lage in einem Wildtyp-Host Gastrula, die dann an 30hpf erhoben wurde, und immunolabeled für alle Axone (α-Tubulin Acetylierte) als Referenz Landmarken für Vorderhirn Anatomie transplantiert. Als Beispiel sei hier gezeigt, konfokale Bildgebung von einem Host Embryo zeigt isolierten GFP + Zellen im ganzen Telencephalon und Zwischenhirn (Abb. 2A). Die vollständige Morphologie dieser GFP +-Zellen können in dieser klonalen Assay beobachtet werden, aufschlussreich, dass die meisten dieser Zellen auf die charakteristischen radialen Gliazellen Morphologie, wo die soma benachbart zu der ventrikulären Zone und eine große Ende zu Fuß bricht eine radiale Prozess am Startplatz Pia Oberfläche (Abb. 2A, Einschub). Dreidimensionale Darstellung der Z-Stapel dieser gesammelten optischen Schnitten zeigte deutlich die Position der Zellen in Bezug auf die markierten Axone (Movie 1). Ein weiterer Ansatz häufig zur Visualisierung von transplantierten Zellen verwendet wird, um zunächst microinject einem fluoreszierenden Farbstoff Zelllinie, wie Alexa 594, in den Dotter eines one-Zelle inszeniert Wildtyp-oder GFP transgenen Embryos. Als Beispiel betrachten wir injiziert Alexa 594 in Wildtyp-Embryonen im Ein-Zell-Stadium. Wir konnten sie zum Schild-Stadium Gastrula entwickeln und dann durchgeführt Vorderhirn gezielten Transplantation, wie oben erwähnt, sondern wir in tg [GFAP: nuc-gfp] transplantiert transgenen Wirt Gastrula. Imaging der dorsalen Telencephalon durch Laser Scanning Konfokalmikroskopie offenbarte fluoreszierende rote Trauben von Spenderzellen unter GFP + Kerne innerhalb des Vorderhirns (Abb. 2B). Wir weiter analysiert diesem Host durch das Sammeln von Z-Stapeln alle drei Minuten über den Verlauf von 2 Stunden mit dem Laser Scanning Confocal. 4-dimensionalen Darstellung dieses Zeitraffer mit Volocity Software (Improvisation) zeigt dynamische zelluläre Bewegungen des Rhodamin Zelle Membranen einend der GFP + Kerne (Movie 2). Klicke hier um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. Abbildung 1: Transplant Apparate und schematische Darstellung der experimentellen Methoden. A) Apparatur zur Gastrula-Stadium Transplantationen durchzuführen. Die Zeiss Lumar fluoreszierenden Stereo-Mikroskop wurde verwendet, um diese Transplantationen durchzuführen. Es hat Joystick gesteuert Fokus und Zoom (linker roter Kreis). Die TransferMan NK verwendet wurde, um die Position der Kapillare, die auch Joystick gesteuert (rechts roter Kreis) zu manipulieren. Während des Setups 60-80 Embryonen werden in die einzelnen Agar Brunnen zuvor in einem 100mm Petrischale mit einer Kunststoff-Form (lila dargestellt Kasten) platziert. Die Transplantation Kapillare (TransferTip) von Eppendorf hergestellt hat einen 15 um Innendurchmesser Öffnung und eine 20-Grad gebogener Spitze (grün umrandet Kasten). Das Streben der Zellen wird mit dem Eppendorf Airtram (rot umrandet Box) gesteuert. B) Darstellung der Gastrulastadium Transplantation von Spender in Host-Embryonen. Embryonen (hier abgebildet) oder Alexa 594 injiziert (wie im Protokoll beschrieben) Spender Embryonen: Die Zellen werden aus tg [GFP GFAP] extrahiert. Die Zellen sind von der Mittellinie auf halbem Weg zwischen dem Schild und animalen Pol entfernt und transplantiert in der gleichen Region von Host-Embryonen. Hosts sind fix und aufgenommen mit konfokaler. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen. Abbildung 2. Beispiel Gastrulastadium Transplantationen innerhalb der Zebrafisch Vorderhirn A) eine Frontalansicht des Wildtyp-Host-Embryonen mit transplantierten tg [GFAP: gfp]. Zellen in der Zwischenhirns und Telencephalon der Zebrafisch Vorderhirn. Axone sind rot gekennzeichnet (α-acetylierte Tubulin-Antikörper) und transplantierten Zellen sind in grün (endogene GFP-Expression) gekennzeichnet. Embryonen sind 30 hpf. Inset zeigt radiale Gliazellen Morphologie der GFP +-Zellen. B) Dorsale Ansicht der Telencephalon einer Live-tg [GFAP: nuc-GFP] host Embryo mit Rhodamin fluoreszierenden transplantierten Zellen (rot). Kerne von Host-Embryonen sind in grünen (GFP) markiert. Eine gestrichelte Linie stellt die vordere Fläche des Zwischenhirns. Die durchgezogene Linie zeigt die ventrikuläre Zone. Scale-Bar ist 10 um. Movie 1. . Das Verhältnis von ektopisch gekennzeichnet radialen Gliazellen unter Vorderhirn Kommissuren Zellen aus einer Gastrula inszeniert tg [GFAP: GFP] Embryos wurden in eine nicht-GFP transgenen Wildtyp-Linie transplantiert. Ein Laser Scanning Confocal Z-Stack wurde gesammelt und dann verarbeitet für 3-D-Rendering mit Volocity Software. Zunächst wird das Bild eine Frontalansicht des Zebrafisch Vorderhirn bei 30hpf, und es wurde horizontal gespiegelt, als im Vergleich zu 2B Abbildung. Axone (a-acetylierte Tubulin, rot) in der vorderen Kommissur (AC, oben) und post-Optik Kommissur (POC, unten) zu sehen sind. Die grünen Zellen sind die GFP + transplantierten Zellen, die Wurzel im Vorderhirn und erzeugt klare radiale Gliazellen Morphologie nahm. Als der Film fortschreitet es konzentriert sich in zwei radialen Gliazellen besitzen Ausgabeaufschlag, dass der POC zu kontaktieren. Klicken Sie hier, um Movie 1 Download. Movie 2. Timelapse Imaging von transplantierten Alexa 594 markierte Zellen im Vorderhirn Zellen aus einer Gastrula zuvor mit Alexa 594 injiziert wurden in tg transplantiert. [GFAP: nuc-gfp] transgenen Embryos. Dieser Film stellt eine 3-D-Projektion eines 2h timeseries, in denen Z-Stapel alle 5 Minuten aufgenommen wurden. Z-Stacks wurden auf einer Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop gesammelt, und 4-D-Renderings fertig mit Volocity Software. Transplantierten Zellen werden mit Alexa 594 (rot) markiert, und GFP + Kerne sind grün. Da diese Zeitraffer läuft, beginnt die 4D-Bild mit einer dorsalen Ansicht des Vorderhirns bei 30hpf und wird über die X-Achse zu drehen, so klar Bewegung in die Zellmembranen aller transplantierten Zellen und in der GFP erkannt + Kerne als auch. Klicken Sie hier Zum Download Movie 2.
