Нерадиоактивные На месте Гибридизация Протокола, применяемыми для Норвегии ель и диапазон видов растений

Это нерадиоактивных мРНК на месте протокол гибридизации оптимизирован для Норвегии тканей ели и подробно описаны. Он основан на Arabidopsis / рапса на месте протокол гибридизации оптимизирована в наших группах, которые, в свою очередь, основан на протоколах от Мейерович и ирландские лабораторий и оптимизированы Вивиан ирландцы, Синди Линкольна и Джефф Длинные среди прочих 1-4. ПОРЯДОК 1. Фиксация и вложения Для обеспечения тканей РНК удержания должны быть зафиксированы и встроенных в воск на месте эксперимент. Фиксации и вложение является важнейшим шагом с слабо закрепленные материалов может дать низкий или неопределяемый сигнал хотя мРНК очень много. Ткани обезвоженной, очищается и встроенных в воске в постепенные изменения, чтобы избежать повреждения тканей. Для дальнейшего избежать усадки и набухания клетки 0,85% NaCl добавляется первые шаги этанола в обезвоживании тканей Норвегии ель. Можно оставить в NaCl в этаноле (например, он остается в Arabidopsis / рапса протокол). Обезвоживания шагом в процессе вложения могут быть выполнены на лед, чтобы сохранить активность РНКазы при минимальной или при температуре +4 ° С. В этом протоколе 4% раствора параформальдегида исправление содержит 0,25% глутарового альдегида, который, как предполагается, чтобы дать лучшее сохранение РНК, хотя некоторые утверждают, что он, вероятно, не имеет значения (например, он остается в Arabidopsis / рапса протокол). Скорее всего, любой стандартный фиксации и вложение протокол может быть использован. Как видно ниже вложение Норвегии ель немного отличается от Arabidopsis / рапса протокола. 1,1 День 1 Сбор растительного материала и параформальдегида фиксации Сбор растительного материала интересов и вскрыть его, если необходимо. Держите ткани на льду и поместить их в ледяной исправить решение (см. рецепты ниже) непосредственно или как можно скорее. NB! Держите на льду все время! Применение вакуума образцы до параформальдегида начинает пузыриться. Держите вакуум на срок до трех часов (например, 2 х 15 мин для Arabidopsis и рапса цветочные ткани или один час для Норвегии ель мужские шишки) и выпуск вакуумного медленно. Ткани, как предполагается, раковина после вакуумной инфильтрации фиксатором, но для некоторых тканях, содержащих много воздуха не представляется возможным (например, цветы Arabidopsis). Кусок марли можно использовать, чтобы сделать пребывание в тканях фиксатором. Замените фиксатор и инкубировать при температуре +4 ° С в течение ночи (~ 12-16 часов), осторожно встряхивая. Вариант 1 NB! Норвегии ель вложение версии ниже (шаги 4-8). Убедитесь, что трубы сцинтилляционных или стеклянные флаконы используются, по крайней мере в шаге 5. 1,2 2-й день обезвоживания NB! Норвегии ель вложение версии. 0,85% NaCl 30 мин со льдом 50% этанол + 0,85% NaCl 90 мин со льдом 70% этанол + 0,85% NaCl 90 мин со льдом Пауза! Можно остановиться на этом и хранения тканей в 70% этанол + 0,85% NaCl при температуре +4 ° С в течение нескольких месяцев. 85% этанол + 0,85% NaCl 90 мин +4 ° C 95% этанола (+ эозином) 90 мин +4 ° C NB! Eosin добавляется в пятно розовой ткани делает их легче обнаружить во вложении и секционирования, но она может быть исключена. 100% этанола (+ эозином) 90 мин +4 ° C 100% этанола (+ эозином) всю ночь +4 ° C 1,3 3-й день обезвоживания и вложение NB! Норвегии ель вложение версии. <ol sтерпкий = "5"> 100% этанола (+ эозином) 2 ч комнатная температура 50% этанол + 50% Histoclear II 1 час комнатная температура 100% Histoclear II 1 час комнатная температура 100% Histoclear II 1 час комнатная температура 50% Histoclear II + 50% Histowax всю ночь +40-50 ° С NB! На последнем этапе концентрации Histowax не критично, просто вылить воск в некоторых фишек. 1,4 День 4 Вложение NB! Норвегии ель вложение версии. 100% расплавленный Histowax +60 ° C (Утром и вечером изменений) 1,5 День 5 Вложение NB! Норвегии ель вложение версии. 100% расплавленный Histowax +60 ° C (Утром и вечером изменений) День 6 1,6 Вложение NB! Норвегии ель вложение версии. 100% расплавленный Histowax +60 ° C (Утром и вечером изменений) NB! Это нормально, если воск иногда меняется раз в день, но тогда это занимает два дня, чтобы завершить один день меняется. Воск изменение может также продолжаться в течение двух дополнительных дней без проблем. Этот режим рекомендуется для больших выборках, поскольку она помогает проникновению воска в центре этих тканей. Вариант 2 NB! Arabidopsis / рапса вложение версии ниже (шаги 4-8). 1,2 2-й день обезвоживания NB! Arabidopsis / версия рапса вложение. NB! Все шаги при +4 ° С и осторожно встряхивая, если не оговорено иначе. 1x PBS 30 мин 1x PBS 30 мин 30% этанола 60 мин 40% этанола 60 мин 50% этанола 60 мин 60% этанола 60 мин 70% этанола 60 мин Пауза! Можно остановиться на этом и хранения тканей в 70% этанола при температуре +4 ° С в течение нескольких месяцев. 85% этанола 60 мин 95% этанола (+ эозином) всю ночь NB! Eosin добавляется в пятно розовой ткани делает их легче обнаружить во вложении и секционирования, но она может быть исключена. 1,3 3-й день обезвоживания и embeddING NB! Arabidopsis / версия рапса вложение. NB! Все шаги, при комнатной температуре и осторожно встряхивая, если не оговорено иначе. 100% этанола (+ эозином) 30 мин 100% этанола (+ эозином) 30 мин 100% этанола (+ эозином) 60 мин 100% этанола (+ эозином) 60 мин NB! Передача ткани сцинтилляционных флаконов или других (стекло) ампул. 75% этанол + 25% Histoclear II 30 мин 50% этанол + 50% Histoclear II 30 мин 25% этанол + 75% Histoclear II 30 мин 100% Histoclear II 60 мин 100% Histoclear II 60 мин 100% Histoclear II + ¼ объема Histowax чип ночь (без встряхивания) NB! На последнем этапе концентрации Histowax не критично, просто вылить воск в некоторых фишек. 1,4 День 4 Вложение NB! Arabidopsis / версия рапса вложение. Место флаконах с тканей при +42 ° С до воска расплавить чипы полностью. Затем добавьте ¼ объема воска чипов, и пусть они расплава полностью. Перемещение до +60 ° С и оставляют флаконах на несколько часов. Наконец, заменить воск / Histoclear II с только что расплавленный воск и инкубировать в течение ночи при +60 ° С. 1,5 День 5 Вложение NB! Arabidopsis / версия рапса вложение. 100% расплавленный Histowax +60 ° C (Утром и вечером изменений) День 6 1,6 Вложение NB! Arabidopsis / версия рапса вложение. 100% расплавленный Histowax +60 ° C (Утром и вечером изменений) NB! В Arabidopsis / рапса протокол (по сравнению с Норвегией ель протокол) есть день за последние 7 Вложение в так же, как в день 5-6, то есть 100% расплавленный Histowax при +60 ° С и изменение утром и вечером NB! Это нормально, если воск иногда меняется раз в день, но тогда это занимает два дня, чтобы завершить один день меняется. Воск изменение может также продолжаться в течение двух дополнительных дней без проблем. Этот режим рекомендуется для больших выборках, поскольку она помогает проникновению воска в центре этих тканей. 1,7 день за последние 7 Вложение (8-й день в Arabidopsis / рапса протокол) (Film! Технические детали показаны в фильме) Разогреть чашки Петри и / или формы при +60 ° С. Поверните на горячей плите (+60 ° С) и убедитесь, что расплавленный Histowax доступна. Налейте тканей и топленого Histowax в чашке Петри (или формы), размещенные на горячую тарелку. Добавить еще Histowax так, что ткани покрыты. Тепло пинцетом и распространять ткани равномерно в блюде. Заполните чашку Петри (или плесень). Если воск затвердевает, прежде чем ткани в правильном положении, тепло его снова или удалить затвердевший воск с подогревом пинцетом. Пусть воск блок затвердевают при комнатной температуре, перед установкой его при температуре +4 ° С. Лучше сделать несколько блоков воск вместо внедрения ткани слишком сильно, так как воск блок может трещину, когда фигуры вырезаны во время секционирования. Пауза! Хранить при температуре +4 &град; C. Тканей, стабилен в течение года. NB! Работа РНКазы свободны от этого шага и далее. Используйте перчатки, DEPC лечению MilliQ воды, буферов, изделия из стекла и т.д., автоклав буферов и выпекать изделия из стекла и т.д., когда это необходимо. 2. Секционирования (Film! Технические детали показаны в фильме) Включите две конфорки (+60 ° С и +42 ° С) и убедитесь, что расплавленный Histowax доступна. Тепло скальпель и осторожно вырезать воска блока ткани из чашке Петри (это может трещина, если он слишком сильным), либо удалить ее из формы. Когда один блок воск был отделен, формы кусок в нужный размер и форму для облегчения нарезки в микротоме. Воск часть должна иметь дополнительный воск "пятки" под ткань, чтобы он мог быть прикреплен к блоку держателя. Тепло держатель блока и пятки на плитке (+60 ° С) и слить их вместе. Возможно, будет необходимо поставить на каплю Histowax II, чтобы сделать слияние стабильной. Пусть это затвердевают при температуре +4 ° С. Вырезать воска блока в 6-8 мкм разделам, связанным в длинную ленту использованием микротоме. NB! Это будет легче, если воск блока холодный, то есть хранить восковых блоков при температуре от +4 ° C и привести его из холодильника при запуске резки. Она также может быть полезно держать нож холодным. Исследование ленты из разделов, в увеличительное стекло и отметьте те, которые будут использоваться. Положите РНКазы без MilliQ воды на слайдах (Probe-On Plus от Фишера биотехнологии, которые предварительно очищают и взимается). Отрежьте ленту на более мелкие куски и положить их ("назад" или "блестящий" стороной вниз) на слайдах. Слайды с ленты должен быть сделан на +42 ° C пластины. Лента должна выравниваться (это важно!) В воде. Пусть разделы сидеть в течение нескольких минут, а затем использовать Kimwipe / папиросная бумага для слива воды. Оставьте скользит по пластине в течение 1-2 часов. Инкубируйте слайдов +42 ° С в течение ночи, так что тканей придерживаться слайдов. Пауза! Рекомендуется использовать разделы, как только возможно, но оно может храниться в сухом в закрытых ящиках с осушителем до нескольких суток при температуре +4 ° С. 3. РЕШЕНИЙ ЗОНДОВ В гибридизация определяет выражение, используя меченым зондом, специфичные для определенных мРНК. Зонда, который чаще всего кусок комплементарной РНК, могут быть помечены дигоксигенин, DIG. DIG это маленькая молекула, которая может быть присоединена к уридина и тем самым включены в РНК-зонда, а затем регистрируется с помощью DIG-специфических антител. Проектировании и изготовлении зонда является наиболее важным шагом в РНК на месте эксперимента гибридизации. Следует проявлять осторожность, чтобы убедиться, зонд имеет высокую специфичность и помечена с высокой UTPs качества. Иногда гибридизации температуры и / или реакции длины должны быть адаптированы для конкретных датчиков. Как всегда, следует проявлять осторожность, чтобы избежать загрязнения РНКазы. Перед маркировки, изолировать шаблона в соответствии с вашими стандартных протоколов, например, использование клонов кДНК, ПЦР-фрагментов, и линеаризовать шаблон. Разум и антисмысловых фрагменты выделяются и усиливаются из шаблонов с помощью генной специфических праймеров. Для ПЦР амплифицированных фрагментов не используют ферменты, которые производят свесы 3 '. Для всех фрагментов T7 (или SP6 или T3) свес добавляется с использованием праймеров проведения T7-последовательности или с помощью вектора с T7-промотора. Смысле (мРНК или (-) нити) зонда есть же последовательности, что целевой мРНК и не скрещиваются с целевой мРНК, в то время как антисмысловых (анти-мРНК или (+) нити) зонда имеют комплементарную последовательность и, таким образом гибридизуются целевой давая сигнал интересов. Смысле зонд используется в качестве отрицательного контроля, и никакой сигнал будет получен, если эксперимент работал должным образом. Положительного контроля также необходима, например, датчик, который обнаруживает дом учета ген. Большинство слайды должны быть гибридизации с зондами антисмысловых, и только несколько слайдов должно быть гибридизации с различных датчиков контроля. 3,1 Зонд маркировки использованием В пробирке транскрипции Реагенты из DIG РНК Маркировка Kit (SP6/T7; 11175025910, Roche Applied Science, Мангейм, Германия) или аналогичные используются при маркировке зондов. 20 мкл реакции, описанные здесь должны давать ~ 10 мкг DIG-меченой РНК. Убедитесь в транскрипции пробирке включение меченых нуклеотидов. Добавить следующие реагенты для трубки (держать на льду): Ингредиент Объем / количество 10 х NTP маркировке смеси 2 мкл 10 х Транскрипция буфер 2 мкл Защитник РНКазы ингибитор 1 мкл (20U) РНК-полимеразы Т7 (SP6 или T3) 2 мкл Шаблон ДНК (500-1000 нг) х мкл РНКазы без MilliQ воды у мкл, в конечном объеме 18 мкл Смешать смесь NTP маркировки, транскрипция буфера, ингибитор РНКазы (NB! если зонд Короче говоря, например, <500bp, вы можете увеличить концентрацию ингибитора РНКазы 40U), полимераза, ДНК-матрицы и воды, а затем кратко центрифуги. Инкубируйте реакционную смесь при температуре +37 ° С в течение 2 часов (NB! если зонд Короче говоря, например, <500bp, увеличение времени реакции до 4-6 часов). Добавить 2 мкл ДНКазы я и инкубировать при температуре +37 ° С в течение 15 мин. Остановить реакцию добавлением 2 мкл 0,2 М ЭДТА (рН 8,0). Проверьте продукт на гель. Осадок зонд путем добавления 2,5 мкл 4 М LiCl и 75 мкл> 99,5% этанола. Хорошо перемешать и инкубировать при температуре -20 ° С в течение ночи (NB! Не используйте тРНК в качестве носителя. Вместо этого используйте гликогена или акриламида в зависимости от производителей). Центрифуга (13 000 оборотов в минуту) в течение 30 минут при температуре +4 ° C и удалить супернатант. Вымойте гранул (по крайней мере 10 мин 13 000 оборотов в минуту) два раза в 70% этаноле (~ 150-300 мкл). Удалить супернатант и пусть гранул сухого. Ресуспендируют зонд в 30 мкл РНКазы без воды в течение 1-2 часов на льду. Пауза! Зонд может храниться при температуре -20 ° С в течение более года. NB! Сохранить 0,5 мкл образцов, начиная с шага 21 (раньше в транскрипции пробирке), шаг 23 (до лечения ДНКазы), шаг 24 (после лечения ДНКазы, но прежде чем осадки) и 1 мкл образца, начиная с шага 27 (когда датчик был ресуспендировали). Выполнить образцов на nondenaturating 1% TBE геля. Если реакция ДНКазы работала должным образом шаблон-диапазона исчезнет. В транскрипции пробирке должна генерировать толстые группы РНК приблизительно правильный размер. Если вы увидите несколько групп, денатурировать образцов при +80 ° С в течение 5 минут с последующей закалкой на льду перед загрузкой. Если о взыскании с шагом 27 выглядит плохо это может быть так, потому что зонд не ресуспендировали хорошо. Инкубируйте РНК при +55 ° С 5-10 минут, чтобы получить его в раствор. 3,2 Гидролиз долго зондов NB! Если зонд больше 150 б.п. она должна быть снижена до 50-150 б.п., чтобы дать сигнал высокого уровня, из-за лучшего проникновения. Зонд может быть химически разлагается в карбонатного буфера (рН 10.2). Если датчик имеет правильный размер пропустить гидролиза шаг, но не забудьте добавить одном томе формамид, то есть 30 мкл, для зонда. Подготовка 0,2 M бикарбоната натрия (NaHCO 3) и 0,2 М карбонат натрия (Na 2 CO 3). Они должны быть свежими. Испытание двух буферов путем смешивания 5 мл H 2 O, 2 мл 0,2 М NaHCO 3 и 3 мл 0,2 М Na 2 CO 3. РН должен быть ~ 10.2. Рассчитайте время инкубации: Время инкубации (в минутах) = (L 0-L е) / (K * L 0 L * е) L = 0, начиная длина зонда в кб L = F конечной длины зонда в кб = например, 0,100 кб K = константа скорости гидролиза = 0,11 КБ-1 мин-1 Гидролиза половину вашего зонд, и откладываю остальное на потом. Развести зонд до 50 мкл РНКазы свободной воды и добавить 20 мкл 0,2 М NaHCO 3 (добавить первая) и 30 мкл 0,2 М Na 2 CO 3. Смешать и инкубировать при +60 ° С в течение расчетного времени инкубации. Остановить реакцию добавлением 10 мкл 1 М NaOAc рН 4,7. Осадок зонд путем добавления 10 мкл 4 М LiCl 2 и 300 мкл этанол (NB! гликогена Использование или акриламида в качестве перевозчика, если это необходимо). Инкубировать при температуре -20 ° С в течение ночи. Центрифуга (13 000 оборотов в минуту) в течение 30 минут при температуре +4 ° C и удалить супернатант. Вымойте гранул в два раза за 70% этанола (~ 300 мкл). Центрифуга (13 000 оборотов в минуту) по крайней мере 10 минут в каждой стирки при температуре +4 ° С. Удалить супернатант и пусть гранул сухого. Ресуспендируют зонд в 30 мкл РНКазы без MilliQ воды. Добавить одном томе формамид, то есть 30 мкл, для зонда. Пауза! Зонд может храниться при температуре -20 ° С в течение более года. NB! Принимать по 2 мкл unhydrolyzed зонда и 2 мкл гидролизованных зонд (до формамида добавляется) и проверить на nondenaturating 1% TBE геля. Там должна быть разница в размерах между двумя образцами. Зондов, возможно, необходимо денатурированного при +80 ° С в течение 5 минут с последующей закалкой на льду перед загрузкой. 4. В гибридизация (Film! Технические детали показаны в фильме) Убедитесь, что все решения РНКазы бесплатно! Это не обязательно, чтобы DEPC-относиться ко всему, но и использовать по крайней мере автоклавного MilliQ воды. Убедитесь, что все изделия из стекла нагревают при +200 ° С в течение ночи или по крайней мере в течение 5 часов. Лечить пластиковые контейнеры и перемешать баров с 0,1 М NaOH при перемешивании в течение ночи. Промыть пластиковые контейнеры несколько раз автоклавного MilliQ воды (~ 500 мл / контейнера). Крайне важно, чтобы промыть контейнеры тщательно, чтобы избежать появления следов NaOH, которые могут беспокоить гибридизации. DEPC лечению всех фондовых решения, за исключением Трис-буфера. Проверьте все решения и т.д., прежде чем начать эксперимент, чтобы убедиться, что все доступно. До шаг 61 (за исключением шаги 51-52) мы держим слайдов в стойке, которая легко перемещается между контейнерами. 4.1 В месте предварительной обработки разделе Deparaffinize / обезвоживают разделах: 2x 10 мин Histoclear II (использование стеклянной тары) 2x 1-2 мин на 100% этаноле 1-2 мин 95% этанола 1-2 мин 90% этанола 1-2 мин 80% этанола 1-2 мин 60% этанола 1-2 мин 30% этанола 1-2 мин H 2 O Вымойте слайды в течение 15-20 минут в 2х SSC при комнатной температуре (NB! Подготовка параформальдегида использовали в шаге 42 в течение инкубационного периода). Лечить тканях в течение 30 мин с протеиназы К при температуре +37 ° С при легком помешивании (например, 1 мкг / мл для Arabidopsis / рапса и 3 мкг / мл для Норвегии ель). Смешать и подогреть до +37 ° C 100 мМ Трис рН 8 и 50 мМ ЭДТА. Добавить протеиназы К непосредственно перед обработкой слайдов. NB! Лечение протеиназы К должна быть оптимизирована в зависимости от ткани, видов растений и возраста. (NB! Подготовка триэтаноламин использовали в шаге 45 в течение инкубационного периода). Лечить слайды в течение 2 мин с 2mg/ml глицина в 1x PBS при комнатной температуре. (NB! Mix глицин с PBS день, прежде чем использовать его, чтобы убедиться, что глицин правильно растворения). Вымойте слайды на 2 минуты в 1x PBS при комнатной температуре. Вымойте слайды на 2 минуты в 1x PBS при комнатной температуре. Инкубируйте слайды в течение 10 минут с 4% (м / о) параформальдегида (из свежего) в 1x PBS рН 7 при комнатной температуре. Используйте стеклянную тару. Вымойте слайды в течение 5 минут в 1x PBS при комнатной температуре. Вымойте слайды в течение 5 минут в 1x PBS при комнатной температуре. (Внесите ангидрида уксусной кислоты в растворе в шаге 45). Инкубируйте слайды в течение 10 минут в 0,1 М триэтаноламин (из свежих, рН 8) и ангидрида уксусной кислоты при комнатной температуре. Вымойте слайды в течение 5 минут в 1x PBS при комнатной температуре. Вымойте слайды в течение 5 минут в 1x PBS при комнатной температуре. Дегидрировать: 30 сек 30% этанола 30 сек 60% этанола 30 сек 80% этанола 30 сек 90% этанола 30 сек 95% этанола 2x 30 с 100% этанола Пауза! Можно остановиться на этом и хранить слайды в контейнере с небольшим количеством этанола в нижней при +4 ° С в течение нескольких часов. 4.2 В гибридизация (Film! Технические детали показаны в фильме) Решите, какие слайды для использования с которой зонды, не забывайте использовать оба смысла и антисмысловых зондов, а также положительного контроля. (NB! ProbeOn Плюс слайды из биотехнологии Фишер имеют белую глазурь, которая позволяет им быть зажат в пар при гибридизации / обнаружению шагов протокола.) То же зонд с той же концентрации должны использоваться на конкретную пару слайдов. Определите, сколько гибридизации решение сделать на основе общего количества слайдов пар. Разогреть сульфат декстрана в +60 ° С. Гибридизации решение очень вязкой из сульфата декстрана. Положите гибридизации решение в +60 ° С, и это будет легче справиться. Воздух сухой скользит по чистой салфеткой или Kimwipe / салфетки перед зонд применяется. Слайды должны быть абсолютно сухими. Для каждой пары слайдов добавить зонда. Важно, чтобы проверить различные концентрации зонда (0,5 например, 2 и 4 мкл), чтобы найти оптимальную концентрацию до фактического эксперимент предварительно. Гибридизация решение 5 пар слайдов 10 пар слайдов 15 пар слайдов 20 пар слайдов 10x на месте соли 100 мкл 200 мкл 300 мкл 400 мкл деионизированной формамида 400 мкл 800 мкл 1200 мкл 1600 мкл 50% декстран сульфат (+60 ° С) 200 мкл 400 мкл 600 мкл 800 мкл 50x Денхардта решение 20 мкл 40 мкл 60 мкл 80 мкл тРНК (100мг/мл) 10 мкл 20 мкл 30 мкл 40 мкл H 2 O (DEPC лечение) 70 мкл 140 мкл 210 мкл 280 мкл Общий объем 800 мкл 1600 мкл 2400 мкл 3200 мкл Развести зонда в РНКазы без MilliQ водой до конечного объема 20 мкл. Добавить один том (т.е. 20 мкл) формамида к зонду что в общей сложности объемом 40 мкл. Тепло зонд до 80 ° С в течение 2 минут. Место на льду в течение 2 мин. Спином вниз. Держите зонд на льду. Этот зонд смеси хватает на одну пару слайдов. Умножить по общему числу слайдов пары для конкретного датчика. Добавить 160 мкл гибридизации решение для каждой пары слайдов дает конечного объема 200 мкл (например, 160 мкл раствора гибридизации + 40 мкл зонда) для каждого слайда пары. Смешайте без образования пузырьков. Применение зонда на один слайд и медленно предохранитель два слайда вместе. (NB! сэндвич может быть сделано только с датчиком-On Plus слайды, слайды или эквивалент. Если слайды без глазури используются использовать крышки скользит вместо сэндвич.) Поднимите слайды выше влажные полотенца бумаги в пластиковый контейнер (который уплотнения плотно) с использованием пластиковых пипеток. Скрещиваться +50-55 ° С в течение ночи (12-16 часов). 4.3 В гибридизация сообщение (Film! Технические детали показаны в фильме) Подготовка в гибридизация сообщение потепления ~ 2 L 0,2 x SSC (+55 ° C) и ~ 2 л 1x NTE (+37 ° C) в течение ночи. Более SSC и NTE необходимы, если лечение РНКазы (шаги 57-59 ниже) не производится. Dip каждого слайда пары в теплую 0,2 x SSC (см. выше), чтобы отделить и промыть их. Затем поместите их в стойке в контейнеретеплой 0,2 x SSC. Вымойте слайды в течение 60 мин в 0,2 x SSC при легком помешивании при +55 ° С. (NB! Подготовка решение Boehringer блок, используемый в шаге 63 в течение инкубационного периода.) Повторите мыться в 0,2 x SSC в течение 60 мин. (NB! Если шаг РНКазы осуществляется пусть оттепели РНКазы в течение этого инкубационного, если не переходите к шагу 60.) Дополнительно: Вымойте слайды в течение 5 мин в теплой 1x NTE (см. выше) при температуре +37 ° С при легком помешивании. Дополнительно: Повторите мыть в теплой 1x NTE в течение 5 мин при температуре +37 ° С с нежным agtation. Дополнительно: Лечить слайды с РНКазы (20 мкг / мл РНКазы в 1x NTE) в течение 30 мин при температуре +37 ° С при легком помешивании. Затем промыть в течение 5 мин в NTE 1x при температуре +37 ° С при легком помешивании. Повторите 1x мыть NTE. Вымойте слайды в течение 60 мин в 0,2 x SSC при +55 ° С при легком помешивании. (NB! Подготовка блока раствор, используемый с шагом 64-65 и 67 во время инкубационного периода.) Вымойте слайды в течение 5 мин в PBS 1x на временный номер (Pause! Вы можете хранить слайды в 1XPBS при +4 ° С в течение ночи, если вы хотите продолжить на следующий день.) Место скользит по нижней части большой пластиковый контейнер с стороной вверх образца. Инкубируйте слайды с 1% Boehringer блок в 100 мМ Трис рН 7,5, 150 мМ NaCl в течение 45 мин при комнатной температуре при легком помешивании. Просто крышка слайды с блокирующим раствором. Вылейте блокирующий раствор в то время как слайды по-прежнему находится в пластиковый контейнер или место слайды в новый контейнер. Когда слива решение слайды обычно придерживаются пластиковый контейнер, но убедитесь, что они не выпадают с контейнером. Замените решение Boehringer блок с 1,0% БСА в 100 мМ Трис рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,3% Тритон Х-100. Выполните инкубации, как в шаге 63. Развести анти-копать антител (1:1250, то есть 8 мкл антител в 10 мл BSA) в BSA / Tris / NaCl / Triton решение, начиная с шага 64. Сделать лужу раствора антител в пластиковом весят блюдо. Сэндвич слайды вместе, чтобы позволить капиллярных сил, чтобы подтянуть решение. Слейте на Kimwipe / папиросной бумаги и повторить, постарайтесь избежать пузырей. Поднимите слайды выше влажные полотенца бумаги в пластиковый контейнер и позволяют слайды сидеть при комнатной температуре в течение 2 часов. Слейте скользит по Kimwipe / бумага ткани и отдельно. Место на нижней части пластикового контейнера, как в шаге 63. Вымойте 4x в BSA / Tris / NaCl / Triton решение. 15 минут каждый раз, нежное возбуждение при комнатной температуре. 10 мин 100 мМ Трис рН 9,5, 100 мМ NaCl, 50 мМ MgCl 2. Место на нижней части пластикового контейнера, как в шаге 63. Dip слайда в Трис рН 9.5/NaCl/MgCl 2 решением для обеспечения всех моющих средств смывается. Сделать бутерброды и составить Западной синий раствор, как в 65. Повторите еще раз. Место слайдов в пластиковый контейнер над мокрыми полотенцами бумаги в полной темноте (завернуть в фольгу) в течение 1-5 дней при комнатной температуре. Проверьте через 6, 12 и 24 часов, то раз в день. Слейте слайды, промыть в 1xTE для остановки реакции. Наденьте крышку скользит перед слайды рассматриваются в микроскоп. Слайды могут быть сохранены в 1x ТЕ в течение нескольких месяцев, но фотографировать как можно скорее. РЕЦЕПТЫ / Фондовый РЕШЕНИЯ NB! Используйте РНКазы без MilliQ водой как можно больше, например DEPC лечению MilliQ воды (Добавить 0,1% DEPC. Оставить на ночь. Автоклав (20 минут на 15 фунтов на квадратный дюйм, то есть 1,05 кг / см 2, на жидком цикла) или использовать в мере автоклавного MilliQ воды. При подготовке буферы и растворы можно также распустить РНКазы без соли и т.д. в DEPC-очищенной воды, а не DEPC обращение с буферами и фондовых сами решения. Если вы не DEPC-очистки воды , буферов и фондовому-решений, по крайней мере автоклаве или фильтр стерилизовать их. Пауза! Магазин буферов и фондового растворах при комнатной температуре, если не оговорено иначе. NB! Вы можете найти многие из буфера, а также советы о том, чтобы сделать их в Молекулярное клонирование (Sambrook, J., и DW Рассела. 2001 года. Молекулярное клонирование Лабораторном руководстве. 3-е изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк, США). Ангидрида уксусной кислоты в 0,1 М триэтаноламин (рН 8, объем: 800 мл). Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация Триэтаноламин 10,4 мл 0,1 М триэтаноламин MilliQ воды 786,4 мл конечного объема 800 мл HCl 3,2 мл давая рН8,0 Ангидрида уксусной кислоты 4,8 мл 0,6% Чтобы 0,1 М триэтаноламин буфере, рН 8,0, развести 10,4 мл триэтаноламина в 786,4 мл H 2 O и добавить 3,2 мл раствора для приведения рН до 8,0 (проверьте с помощью рН индикатор). Поднимите слайд стойке со сломанными 10 мл пластиковые пипетки или аналогичными по своим контейнером триэтаноламин с мешалкой в ​​нижней части. Внесите 4,8 мл ангидрида уксусной кислоты в триэтаноламин несколько минут, прежде чем положить слайды, так что он смешивается хорошо. NB! Сделать 0,1 М триэтаноламин свежие и добавить уксусного ангидрида перед инкубации. NB! Используйте стеклянную тару. Триэтаноламин буфер должен быть использован, так уксусный ангидрид является неустойчивой в воде. Агарозы (1%) гель 1 х КЭ (объем: 100 мл) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация Агароза 1 г 1% 1 х TBE до 100 мл Смешайте агарозы с 1 х TBE. Тепло / варить до агарозном не растает. В ролях геля. Выполнить гель в буфере 1 х TBE. Декстран сульфата Развести 5 г сульфата декстрана до 10 мл DEPC обработанных MilliQ воды (т.е. 50% (м / о)) и растворяют в 60 ° C. Пауза! Хранить при -20 ° C. 0,5 М ЭДТА pH8.0 (titriplex III, объем 500 мл) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация ЭДТА (372,24 г / моль) 93,06 г 0,5 М ЭДТА MilliQ воды до 500 мл NaOH ~ 10 г гранул давая рН 8,0 DEPC 0,5 мл 0,1% DEPC Растворите ЭДТА в воде (происходит при рН 8,0), настроить до конечного объема 500 мл. Добавить 0,1% DEPC. Оставьте на ночь. Автоклав. Fix решения / фиксатор (шаги 1-3, 42) – 4% (м / о) параформальдегида в 1x PBS, рН 7,0 (650 мл) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация MilliQ воды 585 мл 10x PBS 65 мл 1x PBS 10M NaOH 520 мкл давая рН ~ 11 Параформальдегид 26 г 4% Концентрированная HCl 449 мкл давая рН ~ 7 Смешайте воду, PBS и NaOH и нагреть до +60-70 ° С (температура и высокое значение рН будет проще распустить параформальдегида. Добавить (в вытяжном шкафу) параформальдегида. Когда раствор очищается разместить его на лед и отрегулировать рН до 7,0 путем добавления 449 мкл концентрированной соляной кислоты. NB! Сделать свежее. NB! В глутаральдегида протокол ель был добавлен в конечной концентрации 0,25%, т.е. 6,5 мл 25% глутаральдегида в общем объеме 650 мл или 10 мл 25% глутаральдегида в общем объеме 1000 мл (не забудьте уменьшить воду с равными объема). NB! Добавить несколько капель Твин-20 и / или Тритон Х-100, после того, рН, чтобы снизить поверхностное натяжение для облегчения фиксации в шагах 1-3. Не используйте в ШАГ 42! NB! При фиксации растительных тканей меньшем объеме (например, 100 – 200 мл), фиксирующих, как правило, необходимо. 10x на месте соли (объем 100 мл) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация 5 М NaCl 60 мл 3M NaCl 1 М Трис-Cl рН 8,0 10 мл 0,100 М Трис 1 М Na фосфат рН 6,8 10 мл 0,100 М Na фосфат 0,5 М ЭДТА 10 мл 0,050 М ЭДТА MilliQ воды до 100 мл Смешайте буфера фосфата натрия с рН 6,8 (46,3 мл 1 М Na 2 HPO 4 + 53,7 мл 1 М NaH 2 PO 4). Смешайте NaCl, Трис, Na фосфатного буфера, ЭДТА и воды. Автоклав. Пауза! Хранить при -20 ° C. 4 M LiCl 2 (хлористого лития, объем: 100 мл) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация LiCl 2 (42,39 г / моль) 16,956 г 4М LiCl 2 MilliQ воды до 100 мл DEPC 0,1 мл 0,1% DEPC Растворите LiCl 2 в воде, приспособиться к конечного объема 100 мл. Добавить 0,1% DEPC. Оставьте на ночь. Автоклав. Пауза! Хранить при температуре +4 ° С. 1 М MgCl 2 · H 2 O (хлорид магния, объем: 100 мл) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация MgCl 2 · H 2 O (203,30 г / моль) 20,33 г 1 М MgCl 2 · H 2 O MilliQ воды до 100 мл DEPC 0,1 мл 0,1% DEPC Растворите MgCl 2 в воде, приспособиться к конечного объема 100 мл. Добавить 0,1% DEPC. Оставьте на ночь. Автоклав. NB! MgCl 2 очень гигроскопичен. Не храните бутылки открылась в течение длительных периодов времени. 5 М NaCl (хлорид натрия, объем: 1 л) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация NaCl (58,44 г / моль) 292,2 г 5 М NaCl MilliQ воды до 1 л DEPC 1 мл 0,1% DEPC Растворите NaCl в воде, приспособиться к конечного объема 1 л Добавить 0,1% DEPC. Оставьте на ночь. Автоклав. 1 М NaOAc рН 4,7 (ацетат натрия, объем: 100 мл) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация NaOAc (82,03 г / моль) 0,8203 г 1 М NaOAc MilliQ воды до 100 мл Уксусная кислота давая рН 4,7 DEPC 0,1 мл 0,1% DEPC Растворите NaOAc в воде. Скорректировать значение рН до 4,7. Отрегулируйте до конечного объема 100 мл. Добавить 0,1% DEPC. Оставьте на ночь. Автоклав. 0,2 М Na 2 CO 3 pH11.4 (карбонат натрия, объем: 10 мл) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация Na 2 CO 3 </suб> 0,21198 г 0,2 М Na 2 CO 3 рН = 11,4 MilliQ воды до 10 мл Растворите Na 2 CO 3 в воде; приспособиться к конечного объема 10 мл. РН должен быть 11.4. NB! Сделать свежее. 0,2 М NaHCO 3 pH8.2 (бикарбонат натрия, объем: 10 мл) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация NaHCO 3 0,16802 г 0,2 М NaHCO 3: рН = 8,2 MilliQ воды до 10 мл Растворите NaHCO 3 в воде; приспособиться к конечного объема 10 мл. РН должен быть 8,2. NB! Сделать свежее. 1 М Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O (объем 500 мл) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O (177,99 г / моль) 88,995 г 1 М Na 2 HPO 4 MilliQ воды до 500 мл DEPC 0,5 мл 0,1% DEPC Растворите Na 2 HPO 4 в воде, приспособиться к конечного объема 500 мл. Добавить 0,1% DEPC. Оставьте на ночь. Автоклав. 1 М NaH 2 PO 4 · H 2 O (объем 500 мл) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация NaH 2 PO 4 · H 2 O (137,99 г / моль) 68,995 г 1 М NaH 2 PO 4 MilliQ воды до 500 мл DEPC 0,5 мл 0,1% DEPC Растворите NaH 2 PO 4 в воде, приспособиться к конечного объема 500 мл. Добавить 0,1% DEPC. Оставьте на ночь. Автоклав. 5x NTE (общий объем: 1л) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация 5 М NaCl 500 мл 2,5 М NaCl 1 М Трис-Cl рН 8 25 мл 50 мМ Трис-Cl рН 8 0,5 М ЭДТА 5 мл 5 мМ ЭДТА MilliQ воды 470 мл Окончательный объем 1 л Смешайте NaCl, Трис, ЭДТА и воды. Не DEPC лечению. Автоклав. 10 х PBS (фосфатно-солевой буфер) рН 7,0 (общий объем: 1л) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация 5 М NaCl 260 мл 1,3 М NaCl 1 М Na 2 HPO 4 70 мл 70 мМ Na 2 HPO 4 1 М NaH 2 PO 4 30 мл 30 мМ NaH 2 PO 4 MilliQ воды 640 мл Окончательный объем 1 л DEPC 1 мл 0,1% DEPC Смешайте NaCl, Na 2 HPO 4, NaH 2 PO 4 и воды. Отрегулируйте рН до рН 7.0 с HCl. Добавить 0,1% DEPC. Оставьте на ночь. Автоклав. 20x SSC рН 7,0 (общий объем: 1л) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация NaCl (58,44 г / моль) 175,32 г 3 М NaCl Na цитрат (294,1 г / моль) 88,23 г 0,300 М Na цитрат MilliQ воды до 1 л HCl давая рН 7,5 DEPC 1 мл 0,1% DEPC Растворите NaCl и Na цитрат в ~ 800 мл воды. Отрегулируйте рН до рН 7.0 с HCl. Отрегулируйте громкость на 1 л воды. Добавить 0,1% DEPC. Оставьте на ночь. Автоклав. 5 х КЭ (объем: 1л) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация Трис (121,14 г / моль) 54 г ~ 0,45 М Трис Борной кислоты (61,83 г / моль) 27,5 г ~ 0,45 М борной кислоты ЭДТА (372,24 г / моль) 3,7 г ~ 0,01 М ЭДТА MilliQ воды до 1 л Смешайте Трис, борная кислота, ЭДТА и воды. РН должен быть ~ 8.3. Развести в 1 х ТВЕ перед использованием. 10 х ТЕ рН 8,0 (трис-ЭДТА, объем: 1л) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация 1 М Трис-Cl, рН 8,0 100 мл 0,100 М Трис-Cl 0,5 М ЭДТА pH8.0 100 мл 0,050 М ЭДТА MilliQ воды до 1 л Смешайте Трис, ЭДТА и воды. Не DEPC лечению. Автоклав. NB! Трис не следует DEPC обработанные! Используйте РНКазы без порошка и разбавляют DEPC-treated/RNase-free MilliQ воды. 1 М Трис-HCl, рН 7,5 – 9,5 (объем 500 мл) Ингредиент Объем / количество Конечная концентрация Трис (121,14 г / моль) 60,57 г 1 М Трис MilliQ воды до 500 мл HCl давая рН 7,5 HCl давая рН 8,0 NaOH давая рН 9,5 Растворите в Трис DEPC обработанной воды. Отрегулируйте до желаемого значения. Отрегулируйте до конечного объема 500 мл. Автоклав. NB! Трис не следует DEPC обработанные! Используйте РНКазы без порошка и разбавляют DEPC-treated/RNase-free MilliQ воды. NB! В Молекулярное клонирование (см. выше) есть таблица, описывающая, сколько сосредоточиться соляной кислоты, необходимой для достижения правильного рН. Материал и методы На месте протокол представленные выше и в фильме. Здесь дополнительная информация о растительного материала и зонды, используемые в данном конкретном примере описаны. Растительного материала и опытно-конструкторских Мужской конусов от обыкновенная [L.] Карст. (Норвегия ель) были собраны в Упсале, Швеция, осенью 2007 года. Восемь конусы были секционного и разделы изкаждого конуса были использованы в каждой процедуры. Три протеиназы К концентрации были протестированы, 1, 3 и 5 мкг / мкл и каждой концентрации лечились или без РНКазы. Слайды не лечить РНКазой были оставлены в PBS в течение лечения РНКазы. Arabidopsis thaliana [L.] Heynh. и Brassica париз L., выращенных в контролируемых условиях в культуре камера с 22 ° C/18 ° C день / ночь температур и фотопериода на 16 ч. Молодые соцветия содержащие цветочные бутоны, 0-10 этапов (стадий согласно Смит 5) были изучены. кРНК зондов Общую РНК выделяли из P. обыкновенная мужские шишки, как описано выше 6 и от А. thaliana и B. париз использованием TRIzol (Gibco BRL, Фредерик, штат Мэриленд, США) и Qiagen RNeasy завод Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия), соответственно, в соответствии с рекомендациями производителя. КДНК синтезировали из 0,5-1 мкг тотальной РНК, в зависимости от вида, используя Надстрочный III обратной транскриптазы (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. AtAP3 и BnAP3 смысл и антисмысловых фрагменты и П. обыкновенная фрагменты смысле были выделены и усиливается использованием гена специфических праймеров (табл. 1). DAL13 фрагменты антисмысловых были выделены и усиливается с использованием праймеров, как в 7. Свес T7 был добавлен в фрагменты из A. thaliana и П. обыкновенная с использованием модифицированной обратных праймеров проведения T7-последовательности (табл. 1). 500 б.п. фрагмент был выделен с использованием BnAP3 специфических праймеров (табл. 1) и клонировали в pGEM-T вектор с T7-промотора. Для П. обыкновенная фрагменты всех ПЦР проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащей 0,2 U Phusion высокого Fidility ДНК-полимеразы (Finnzymes, Эспоо, Финляндия), 1x Phusion HF буфера, 200 мкМ каждого дНТФ, 0,3 мкМ каждого грунтовки и 25-50 нг кДНК и стандартной программы ПЦР был использован с температуры отжига 60-55 ° С (приземления -1 ° C / цикл), а затем 55 ° C. Разум и антисмысловых кРНК зонды для всех трех видов были синтезированы в пробирке с использованием транскрипции РНК-DIG Маркировка Kit (SP6/T7; Рош Прикладные науки, Мангейм, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя и длинные зонды усваивается примерно до 100-150 б.п. фрагментов с использованием Na 2 CO 3 буфер в соответствии с 3. РЕЗУЛЬТАТЫ Здесь, в результате разделе мы описываем три различных примеров типичных результатов экспериментов на месте. Генетический механизм, который регулирует репродуктивного развития у голосеменных и покрытосеменных, указав мужских и женских органов личности, как представляется, эволюционный сохраняется 7-9, несмотря на это двух линий завода семян разделенных 285 миллионов лет назад 10. В А. thaliana цветочный гомеозисных генов APETALA3 (AP3 11) и PISTILLATA (PI 12) являются необходимыми и достаточными для указания мужчин репродуктивного развития в контексте цветок, и эта функция, как представляется, сохраняется в течение покрытосеменных линии 13. В голосеменных, у которых нет цветов и их половых органов, расположенных в отдельные мужские и женские шишки (рис. 1А-C), гены гомологичные AP3 и П. И. конкретно выражается в пыльце органов подшипник мужской конуса, микроспорофиллы 7,14. Таким образом, подобный набор гомологичных генов в обоих покрытосеменных и голосеменных определяет пыльцы несущих органов. Гена специфических зондов направлена ​​против AtAP3 и BnAP3, соответственно, дал сигналы от этапа 3 молодые цветочные почки в области, соответствующей оборота двумя и тремя А. thaliana и B. париз. В более поздних поставил почки сигналы были ограничены развивающимися лепестков и тычинок (рис. 2А и В). Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями, 11,15,16. Зонды направлены AP3 гомолог в P. пихта, DAL13, произведенных сигналов в микроспорофиллы П. обыкновенная мужские шишки и до, и после прекращения апикальной меристемы (рис. 2, и D), как и ожидалось из предыдущих исследований 7,14. Смысл зондов не дал сигнала над фоном (рис. 3-Б и данные не приведены). Взятые вместе, эти результаты показывают, выражение А. AP3 thaliana и его ортологи в B. париз и П. обыкновенная в развитии мужских половых органов. Рисунок 1. A.thaliana и B. париз цветы и пыльца производству мужские шишки из хвойных П. обыкновенная Картинки показывают соцветия с цветочными почками и открытые цветы A.thaliana и B.napuы в А и В соответственно. Обратите внимание, что цветы покрытосеменных, кроме стерильных околоцветника гаваней мужских и женских половых органов; тычинок и плодолистиков. Показанный в С веточка голосеменных П. обыкновенная с зелеными иглами вегетативного и красный репродуктивные мужские шишки. Рисунок 2. Выражение А. thaliana AP3 и гомологичных генов в B. париз и П. обыкновенная. Микрофотографии показывают, продольные срезы А. thaliana и B. париз соцветий и В, соответственно и П. обыкновенная мужские шишки на С и D. Разделы гибридизации с зондами антисмысловых направлена ​​против AtAP3 в BnAP3 и в B-шоу сигнала во втором и третьем обороте цветочных органов. Номера указывает цветочными этапов в соответствии с Смит 5. Антисмысловые зонд направлены DAL13 гена дал сигнал в пыльце микроспорофиллы подшипник П. обыкновенная мужские шишки, как показано на компакт-диске. Примеры микроспорофиллы указаны стрелками. Стрелки АД указывают на гибридизации сигнал, который выглядит как фиолетовый. В C и D фенольных соединений дает коричневато неспецифической цвет отдельных клеток в центральной сердцевины. с, чашелистик; р, лепесток; й, тычинки; с, пестика; мс, microsporophyll; пи, сердцевина; п.п.; предварительно клетки пыльцы. Бар: 100 мкм. Рисунок 3. DAL13 выражение в мужские шишки из P. обыкновенная. Все Микрофотографии (АГ), показывают продольных срезах мужские шишки после прекращения апикальной меристемы. Стрелки указывают на типы клеток, в которых DAL13 выражено. Разделы А и В гибридизации с зондом смысле управления для определения фонового окрашивания. Микрофотографии С до Н гибридизации с зондом антисмысловых DAL13. Разделы из экспериментов с и без РНКазы лечения приведены в D, F, H и C, E, G, соответственно. Микрофотографии из опытов с 1 мкг / мл протеиназы К показаны на С и D, 3 мкг / мл в Е и F, и 5 мкг / мл в G и H. Bar: 100 мкм.