Сбор костного мозга от бедра и голени Первый этап процедуры для сбора костного мозга от бедра и голени 6 – на 12-недельных мышей (мы используем BALB / с мышами, но вы можете сделать эту процедуру с любым мыши деформации). Во-первых, усыпить мыши СО 2 ингаляции (не будет показан). Урожай бедра и голени от задних ног каждого из них. Затем, с лезвием, разрезать каждый конец бедренной кости для удаления тазобедренных и коленных суставах и разоблачить мозга. Таким же образом, сократить каждом конце голени, чтобы удалить коленного и голеностопного прилегающих районов и разоблачить мозга. Возьмите 3 мл шприц с 26-иглы и залейте его RPMI с добавлением 10% FBS, пенициллин, стрептомицин, и бета-меркаптоэтанола (BME = 100 мкм). С помощью пинцета держать кости более чашки Петри содержащей RPMI СМИ. Вставьте иглу шприца в один конец кости и нажмите поршень, чтобы избавиться от костного мозга. Иглу шприца можно перемещать вверх и вниз внутри кости, чтобы избавиться от остаточных мозга. Повторите процедуру для всех костей, а затем продолжить создание культур. Создание культур Установить кости культур мозга, пипетки вспыхнул костного мозга вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить ткани в клеточной суспензии. Место 70 микрон фильтр на вершине 50 мл коническую трубку, и добавить клеточной суспензии в фильтр. Полоскание чашки Петри одно время с RPMI, а затем добавить промыть в фильтре 70 мкм. Использование резиновых конце 1 мл шприца, перемалывать кости частей мозга, оставшиеся на начало 70-микронный фильтр. Промойте фильтр один раз с RPMI. После промывки фильтров, центрифуг клеточной суспензии при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут. Промыть осадок клеток путем суспендирования в PBS. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Как правило, мы получаем ~ 90 миллионов клеток из костей одним кликом (две бедренные кости и две голени). После подсчета клеток, центрифуги их снова при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут. Ресуспендируют клетки в небольшом количестве RPMI и аликвоту их в культуре ткани колбы, содержащие достаточно RPMI так, чтобы конечная концентрация составляет 1 млн. клеток в мл. Добавить цитокинов способствовать развитию вашего типа клеток, представляющих интерес. В этом случае, цитокина интерлейкина-3 (IL-3 = 10 нг / мл) в целях содействия развитию базофилов и тучных клеток. Для приобретения базофилов, инкубировать в течение 10 дней. Для тучных клеток, инкубировать в течение 5 недель. При создании тучных клеток, средств массовой информации и IL-3 должен быть изменен раз в неделю. Вот посмотрите, как тучные клетки должны появиться сразу после металлизации. Это изображение показывает дифференциацию тучных клеток мозга в базофилов и тучных клеток через 10 дней после того интерлейкина-3. Как только желательный тип клеток получается, переходите к шагу электропорации. Клетки Electroporating Для начала электропорации шаг, определить количество клеток в культуре колбу. Клетки, как правило, электропорации при плотности 10 миллионов в мл, поэтому передача необходимого количества ячейки конических труб и труб центрифуге при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут. После центрифугирования, аспирация СМИ, мыть клетки с 1X PBS, и вновь центрифуге при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут. Аспирируйте PBS и добавьте Bio-Rad Гена Pulser электропорации буфера, чтобы сделать клеточную суспензию из 10 миллионов клеток на мл. После ресуспендирования клеток, добавьте нужные ДНК плазмиды в конечной концентрации от 10 до 20 мкг на мл. Алиготе 150 мкл суспензии клеток в лунки свой выбор на 96-луночного электропорации пластины. Положите электропорации пластины в камере пластины MXcell и закрыть крышкой. До трансфекции тучных клеток, электропорации протокол должен быть запрограммирован в MXcell за исключением использования предустановок или хранится протокол. Благодаря оптимизации экспериментов мы обнаружили, что высокая эффективность трансфекции тучных клеток происходит с помощью квадратных протоколов пульсовой волны. Мы будем меняться электропорации условий на пластине для доставки 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms и 350V/10ms импульсов прямоугольной волны в конденсатор на 2000мкФ и 1000 Ом. Как только протокол был установлен и загружен на устройства, нажмите «Пульс», чтобы electroporate клеток. После электропорации завершения передачи клеткам планшета для культуры ткани. Как правило, мы передачи по 150 мкл электропорации образец хорошо в 48-луночного культуре ткани пластину, содержащую 300 мкл RPMI (с добавлением 10% FCS, пенициллин, стрептомицин, и бета-меркаптоэтанол) с 10 нанограмм на мл интерлейкина-3. Клетки инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° С, затем анализировали через 24 часа для выражения мнения и подавление. ТранРезультаты sfection Флуоресцентное изображение микроскопии клеток после успешного электропорации с использованием 20 мкг на мл GFP плазмиды показан на видео. Использование электропорации MXcell системы трансфекции эффективности около 30% могут быть получены. Система позволяет варьировать условия для максимальной эффективности трансфекции, сохраняя жизнеспособность клеток.