DNA-replicatie heeft drie hoofdstappen: initiatie, verlenging en beëindiging. Replicatie in prokaryoten begint wanneer initiator-eiwitten binden aan de enkele oorsprong van replicatie (ori) op het circulaire chromosoom van de cel. Replicatie verloopt dan rond de hele cirkel van het chromosoom in elke richting vanaf twee replicatievorken, wat resulteert in twee DNA-moleculen.
Replicatie wordt gecoördineerd en uitgevoerd door een groot aantal gespecialiseerde eiwitten. Topoisomerase breekt één kant van de dubbelstrengs DNA-fosfaat-suiker-keten, waardoor de DNA-helix sneller kan afwikkelen. Helicase verbreekt de bindingen tussen basenparen bij de vork, waardoor het DNA in twee strengen wordt gescheiden. Eiwitten die enkelstrengs DNA-moleculen binden, stabiliseren de strengen terwijl de replicatievork langs het chromosoom reist. DNA kan alleen in de 5 'naar 3' richting worden gesynthetiseerd, dus één streng van de template – de leidende streng – wordt continu verlengd, terwijl de andere streng – de achterblijvende streng – wordt gesynthetiseerd in kortere stukken van 1000-2000 basenparen, Okazaki-fragmenten genaamd.
Veel van het onderzoek om prokaryotische DNA-replicatie te begrijpen, is uitgevoerd in de bacterie Escherichia coli, een veelgebruikt modelorganisme. E. coli heeft 5 DNA-polymerasen: Pol I, II, III, IV en V. Pol III is verantwoordelijk voor het grootste deel van de DNA-replicatie. Het kan ongeveer 1.000 basenparen per seconde polymeriseren. Door deze verbazingwekkende snelheid kan de machine die aanwezig is bij de twee replicatievorken het E. coli- chromosoom – 4,6 miljoen basenparen – dupliceren in ongeveer 40 minuten. DNA-polymerase I is ook goed gekarakteriseerd; zijn primaire rol is het verwijderen van de RNA-primers vanaf het begin van Okazaki-fragmenten op de achterblijvende streng.
Bij stabiele groeiomstandigheden zal E. coli zich elke 20 minuten delen, ongeveer de helft van de tijd die nodig is om het genoom te repliceren. Hoe is dit mogelijk als beide dochtercellen hun eigen DNA moeten hebben? Wetenschappers ontdekten dat de bacteriën een nieuwe ronde van DNA-replicatie kunnen beginnen vanaf de oorsprong van replicatie voordat de eerste ronde is voltooid; dit betekent dat dochtercellen een chromosoom krijgen dat al gekopieerd wordt en bereidt is zich zeer snel weer te delen.
