Overview
ソース: 研究室の博士アナ ・ j ・ ガルシア-Sáez-テュービンゲン大学
興味のほとんどのサンプルは、多くの異なるコンポーネントの混合物です。試料の調製、分析プロセスの重要なステップは、干渉分析に影響を与える可能性がありますそれを削除します。など、分離技術の開発は学界だけでなくだけでなく、業界の重要な試みです。
混合物を分離する方法の 1 つは、その溶解性のプロパティを使用します。この短い論文で水溶液を取り扱います。興味の化合物の溶解度は、ソリューション、pH (2) および (3) 温度の (1) イオン強さによって決まります。これらの 3 つの要素を自在に操り、目的の化合物をサンプルの残りの部分から削除する化合物が水溶性ではない条件を使用できます。1
Principles
パラメーターの数は、図 1に示すように、溶解性を削減し、固体としてのソリューションから削除することによって不純物から目的の標本を分離する使用ことができます。 まず、溶液のイオン強度を変更すると、物質の溶解度が変更できます。 余分な塩 (塩析とも呼ばれます) の添加、または関心の化合物の少ない水溶性種を形成する対イオンの追加が伴います。2
図 1。容解性の平衡温度、pH、イオン強度を受けます。興味 (黄色) の化合物は、溶媒に対する溶解性を変更することによって (赤) の不純物から分離されます。
溶液の pH を変更すると、化合物の純充満が変更可能性があります。特定の pH で純充満 (等電点とも呼ばれます) ゼロになるし、化合物が最終的に固体を形成、水に難溶になります。温度は、高温固体の溶解度が増加また、溶解度に影響を与えます。
立体形成のレートは、相対的な純度 (図 2) を決定します。一般に、降水量が急速なペースで固体の形成を指しますそれによって生産いくつかの不純物を含む非晶質試料内に閉じ込められました。これは塩析と pH 変化により誘起プロセスで一般的です。このプロセスは遅く、不純物、敷地内でトラップされない、比較的純粋な固体が生成されます。再結晶にこの手法を採用します。このプロセスで化合物は高温で飽和点にだけ十分な溶媒に溶解しました。この飽和ソリューション後ゆっくりとクールダウンに実行されます。ソリューションを冷却すると、コンポーネントの溶解度の減少と溶解度を超える化合物を形成する非晶質の固体ではなく秩序固体 (結晶として知られている)。溶液中の不純物は閉じ込められてしまうは、閉じ込められている前に、遅いプロセスは固体の表面でこれらの不純物の除去することができますありません。1
図 2。沈殿物と結晶の違い。
固体が形成 (結晶としてかどうかまたは沈殿物) 混合物の残りの部分から分離する必要があります。ろ過はそれらを分離する方法の 1 つであります。これは、固体の物質が、ソリューションではなく通路を選択的に抑制する多孔質材料を採用しています。
遠心分離は混合物の残りの部分から沈殿物を分離する別の方法です。遠心分離は、その密度に基づく混合物を分離するのに求心性加速を使用します。ソリッド以降は水溶液、容器の底に固体の堆積物よりも密度が高い。固体はペレットと水溶液、清とも呼ばれます。上清はデカントしすることができます。 またはピペットやスポイトを使用して抽出します。結晶は壊れやすい、ソリューションからそれらを分離する遠心分離を採用してよくないです。
このビデオは、(塩析、pH の変化と再結晶) 固体の形成とろ過または遠心分離による水溶液からの後続の除去で化合物を分離するさまざまな方法をカバーします。
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Procedure
1. CaCO3の沈殿物
- 1 M CaCl2の 5 mL を準備します。
- 5 mL 1 M Na2CO3を準備します。
- 小型遠心分離機管 (1.5 mL)、CaCl2の 750 μ L と Na2CO3750 μ L を追加します。
- 2 分が発生する反応を待ちます。ソリューションは、曇りにする必要があります。
- 5 分 10,000 × g で混合物を遠心分離機します。
- 上清をデカントします。
- ペレットに冷たい水の 1 mL を追加します。
- 10 の渦のミキサーで混合することによって、ペレットを再懸濁します s。
- 5 分 10,000 × g で混合物を遠心分離機します。
- 上清をデカントします。
2. ミルク蛋白質の沈殿物
- ビーカーにミルクを注ぐと攪拌棒します。
- 攪拌ホット プレートで 40 ° C まで軽く温めた牛乳。40 ° C 以上に加熱しないでください。
- 7.5 mL の酢酸を混合し、50 mL に達するに十分な水で希釈することによって酢酸の 15% (v/v) を準備します。
- 温めた牛乳に pH メーターの電極を浸し、pH を監視します。
- 酢酸はミルクに 4.6 の pH に達するまで drop-wise 追加します。
- ミルクのろ過
- フィルターの紙の部分をフルートし、目標到達プロセスにそれを置きます。
- フラスコ、漏斗を置き、漏斗に酸性化したミルクの溶液を注ぐ。
- ソリューションが注がれている、フィルター紙が詰まる可能性があります。攪拌棒を使用すると、ソリューションとフィルターの詰まりを取るために時々 紙を揺り動かしなさい。ソリューションの通路を改善しない場合は、ろ紙を変更します。
- 新しいフィルター ペーパーを固体ベンチ上部とウェットの転送の新しいフィルター ペーパーを配置します。これは固体からより多くの水を吸収する必要があります。
- 新しいフィルター ペーパーを濡らしても場合、は、フィルター紙の湿りの最小限の量になるまでそれを変更していきます。多くの水を吸収するために必要な場合に軽く押し込みます。
- 乾燥した固体を取り、約 70% で再停止エタノール。もう一度手順 2.6.1 に 2.6.5 固体をフィルター処理します。
- (ろ過に代わる) としてミルクの遠心分離
- 50 mL 遠沈管に混合物の 50 mL の部分を転送します。
- 4,500 × g 10 分間遠心し、上清をデカントします。
- 50 mL 70% エタノールをペレットに追加します。
- 攪拌棒を使用して、エタノールでペレットを再懸濁します。
- 次のステップ 2.7.2 この懸濁液を遠心します。
- そうでなければ 4 ° C で保存しておき、SDS-PAGE などさらなる分析用のバッファーでペレットを再懸濁します
3. KCl の再結晶
- エルレンマイヤー フラスコ、KCl の 50 g の重量を量るし、100 mL の水を追加
- 水が沸騰するまで混合物を加熱します。すべての KCl の粉が溶けていることを確認します。いくつかの不純物が水には溶けません。
- 熱混合物と一緒に別の (空の) 三角フラスコと非常に暖かい保つこと。
- 暖かく、空のフラスコに濾紙と漏斗を配置します。
- 不溶の不純物を取り除くフィルター ペーパーを通して溶液を注ぐ。受信側のフラスコは原油の沈殿物を形成するが、それ以外の場合濾過中に温度変化が発生しないように暖かくしておいた。その場合、すべての沈殿物が溶けるまで再加熱混合物。
- ソリューションとフラスコを暑さから削除します。
- 部屋の涼しい場所に保管して、それはまたはそれはもはや触ると暖かくなるまで、約 30 分間ゆっくりとクールダウンできます。
- 部屋の温度に冷却、一度温度を下げるを氷浴にフラスコを配置します。また、1 つは冷蔵庫または 4 ° C で温度管理された部屋の中のフラスコを残すことができます。
- 手順 3.4-3.5 のようにフィルタ リングが結晶を収穫 (フラスコを使用し、室温で漏斗)。
沈殿物はその成分の溶解性に基づく混合物の分離に使用される手法です。化合物の溶解度は、ソリューション、その pH および温度のイオン強さによって決まります。これらの要因の操作は、不溶性の固体になり解決から落ちることが化合物を可能性があります。これは沈殿物と呼ばれます。
不溶性の固体、最初沈殿物の,と呼ばれるソリューションには分散よく意味、懸濁液を形成します。沈殿物は通常の塊と液体から分離、沈殿、遠心分離、ろ過によって。このビデオは沈殿物を用いた化合物を分離するいくつかの方法を紹介し、研究室では、手順をデモンストレーションします。
溶存化合物は、イオン導入することによって解決から沈殿することができます。たとえば、銀は、硝酸銀と塩化ナトリウムとの反応で解決から沈殿することができます。硝酸イオンは、対イオン、塩化物、固体の塩化銀の形成の結果で置き換えられます。
溶液の塩濃度を増加降水量を誘発することができます。このテクニック、塩析はタンパク質の分離一般的です。高い塩濃度で水の分子より少ない蛋白質を安定させるために残して、溶存塩に惹かれます。その結果、蛋白質分子および固体を形成を集約します。
降水量は、pH の変化によって引き起こされることができます。高、低 ph、蛋白質は充電、極性溶液に魅了。特定の時点で化合物の純電荷がゼロになります。これは等電ポイント、または pI です。化合物ではそれを集計して沈殿を引き起こして、極性溶液との対話ができません。
温度は、高温固体の溶解度が増加また、溶解度に影響を与えます。温度を減少させることによって溶存化合物を固める再することができます。立体形成のレートは、相対的な純度を決定します。
次の実験は、牛乳の pH、ろ過、遠心分離のメソッドを介してさらに分離してからタンパク質カゼインの沈殿物を説明します。
この手順を開始するには、攪拌棒でビーカーにミルク 250 mL を追加します。優しく攪拌ホット プレート上の 40 ° C に牛乳を温めます。温めた牛乳に pH メーターを浸漬し、pH を監視します。PH 4.6 カゼイン等電点に達するまでに、酢酸をミルクに drop-wise 追加します。不溶性の牛乳タンパク質や凝乳は、等電点で解決から沈殿させます。濾過により、ソリューションから凝乳を削除します。濾紙が目詰まりを取得する場合流れる解決の手助けにヘラで混ぜます。ろ過が改善しない場合は、フィルター紙を変更します。新しいフィルター ペーパーに詰まっているろ紙からウェットの固体を転送します。これは以上の液体、または固体からホエーを吸収する必要があります。最小限の湿りがあるまでフィルター用紙の変更を続行します。固形物を軽く押すともっとホエーを吸収するフィルター ペーパーが役立つことがあります。
再凝乳からリン脂質を洗浄し、ろ過処理を繰り返します 70% エタノールで乾燥ミルク固体を中断します。ろ過する代わりに、タンパク質の固体も分離できる遠心分離を使用します。ミルクの混合物の 50 mL の部分を遠心し、上清をデカントします。再、凝乳からリン脂質を除去するために 70% エタノール 50 mL にペレットを中断し、遠心分離処理を繰り返します。
ミルク蛋白質の固体は保存または再別のソリューションの詳細な分析、SDS-PAGE などで中断できます。詳細については、この技術の私達のビデオを参照してください。SDS ページの解析は、降水にホエーからほとんど不純物の除去が有効になっているを示しています。中清で見つかりませんでした、カゼインのすべては、ペレットで発見されました。
沈殿物は、別の様々 な混合物またはソリューションに適用可能な一般的に使用される手法です。
化合物は、炭酸カルシウムの沈殿物のこの例のように、イオンを使用したソリューションから沈殿することができます。
塩化カルシウムと炭酸ナトリウム、水相中に溶解。
混在する場合カルシウムと炭酸塩は、遠心分離で分離できる、不溶性の固体を形成します。このトピックの詳細については、溶解度のルールに私たちの教育のビデオを参照してください。
降水量は、ナノテクノロジーのアプリケーションの広い範囲で発見されているナノ ・ ソリッドの準備に利用できます。この例では、ナノスケールの種子は、ナノ結晶の成長を制御する使用されました。
前駆体が加熱、trioctylphosphine セレンと反応し、急速に冷却します。、メタノールは、固形物を沈殿させるために冷却ソリューションに追加されました。結晶は、遠心分離によって回復された、および x 線回折による結晶構造解析。
沈殿物は、医薬品配送用高分子配位子の準備に使用できます。この例では、配位子が合成・ プラチナ抗がん剤治療として使用するために活用されます。まず、リガンドは、アミド カップリング反応を利用して合成しました。それは、反応が進むにつれて沈殿。それはろ過を用いたが、回復しました。
固体は、再結晶化を使用して浄化し、再びフィルタ リングします。リガンドできたプラチナ化合物は、乾燥し、アセトンと水から分別沈殿を使用して浄化し。核磁気共鳴分光法を用いた白金結合が確認されました。化合物は、抗がん剤としての効果と副作用の検討でした。
沈殿物を使用して混合物の分離にゼウスの導入を見ているだけ。今沈殿物、および実験室でこれらの実験を実行する方法の様々 な方法を理解する必要があります。
見てくれてありがとう!
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Results
容解性の平衡は、多くの精製プロセスで採用されています。 カルシウムは、炭酸ナトリウムを使用して水から削除できます。3炭酸カルシウムの溶解度積 (K ・sp) は、4.8 × 10-9です。CaCl2 1 M と 1 M Na2CO3の混合 CaCO3沈殿物が生成されます。沈殿物は、遠心分離を使用して、ソリューションの残りの部分から分離されました。
カゼイン (牛乳の主要蛋白質) は pH 4.6 で等電点をこの pH で不溶性の凝乳を形成します。凝乳し、ろ過または遠心分離 (図 3 a) のいずれかを使用して、ソリューション (また呼ばれる乳清) の残りの部分から分離されました。豆腐は、豆腐のリン脂質とも閉じ込められた他の水溶性化合物を削除し、エタノールで洗浄しました。遠心分離はろ過より蛋白質の損失を防止するフィルター ペーパーに付いたいくつかの蛋白質があったので。分離した成分を沈殿物の反作用がホエーからカゼインのほとんどを分離を示す SDS ページ (図 3 b) を使用して行った。グロブリンなど、他の牛乳蛋白質のカゼインとともに沈殿物します。これ以降の手順は、カゼイン蛋白質の残りの部分から分離するため適用されるかもしれません。
降水量は、しかし、それはまたマトリックス内のいくつかの不純物をトラップできる、固体からほとんど不純物を削除します。再結晶は固体 (図 4) をさらに浄化するためによく使用されます。この実験では固体は固体が非常に水溶性ではない溶剤でまちまちだった。混合物の温度は溶媒の沸点に育てられたと熱い溶媒を飽和させるのに十分な固体が追加されます。他の不溶解性の不純物は、濾過のステップを介して削除でした。高温の溶液は、徐々 に室温まで冷却し、冷却冷蔵庫/コールド ルーム/氷浴でさらに。ゆっくりとしたプロセスは非晶質の沈殿物ではなく結晶になった水溶性の不純物は結晶格子に反映されていなかった、結果結晶された原油の沈殿物より比較的もっと純粋です。結晶は、空気 (または真空) を乾燥するろ過、左を使用して収穫しました。
図 3。ミルク蛋白質の沈殿物。(A)ミルク蛋白質の隔離のステップごとの写真。(B) SDS、さまざまなサンプルのページ
図 4。KCl の結晶。
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Applications and Summary
沈殿生成反応は、多くのサンプルの準備プロセスに適用されます。前に述べたように、彼らは塩またはその容解性の平衡によって特定のイオンを削除する使用できます。彼らは、混合物からタンパク質などの生体分子を削除する使用できます。
再結晶がよく、さらに固形物を浄化するために採用します。このプロセスは、固体内で閉じ込められた不純物を削除します。とりわけ、再結晶塩と有機分子を浄化するために使用できます。
遠心分離やろ過技術は、溶媒から非水溶性成分を分離するほとんどのサンプル準備要求に適用されます。ろ過は、溶剤から純粋な結晶化化合物を分離する有機化学で頻繁に使用されます。また、天然物有機化学や分析化学で固液抽出後使用されます。遠心分離がよく使用されます別の密度のようにとの混合物を分離するここで乳成分と沈殿した塩の分離に適用。
生化学、タンパク質、脂質、DNA の隔離などほとんどのプロセスは沈殿生成反応のサンプルを浄化するために遠心分離やろ過の方法。これらのプロセスのほとんどは、商業キットに完全に標準化されている、そこはまだ最適化のための部屋の多く異なる生体分子が異なる条件を必要と。
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References
- Kotz, J., Treichel, P., Townsend, J. Chemistry and Chemical Reactivity. 8th ed. Brooks/Cole, Belmont, CA (2012).
- Arakawa, T., Timasheff, S.N. Mechanism of Protein Salting In and Salting Out by Divalent Cation Salts: Balance between Hydration and Salt Binding. Biochemistry. 23, 5912-5923 (1984).
