Sigma's Niet-specifieke protease activiteit Assay - caseïne als een substraat

Voor het begin van de test, moeten we ervoor zorgen dat de volgende reagentia correct zijn bereid: Een 50 mM kalium fosfaatbuffer, pH 7,5. Voor te bereiden met behulp van 11,4 mg / ml van kalium fosfaat tweebasisch, trihydraat in gezuiverd water en aanpassing van de pH met 1M HCl. Deze oplossing wordt geplaatst bij 37 ° C voor gebruik. Een 0,65% gewicht / volume caseïne-oplossing, bereid door het mengen van 6,5 mg / ml van caseïne in de 50 mM kalium fosfaat buffer. Geleidelijk verhoogd de oplossing temperatuur met zacht roeren tot 80-85 ° C gedurende ongeveer 10 minuten tot een homogene dispersie is bereikt. Het is zeer belangrijk niet aan de kook de oplossing. De pH wordt vervolgens aangepast, indien nodig met NaOH en HCl. Een 110 mm Trichloorazijnzuuroplossing, bereid door verdunning van een 6.1N voorraad 01:55 met gezuiverd water. Trichloorazijnzuur is een sterk zuur en moet met zorg worden behandeld. 0,5 mM Folin & Ciolcaltea, of fenol reagens Folin, die is de oplossing die zal reageren met tyrosine tot een meetbare kleur verandering die rechtstreeks zal worden gerelateerd aan de activiteit van proteasen te genereren. Fenol Reagens Folin is een zuur en moet met zorg worden behandeld. Een 500 mM natriumcarbonaatoplossing, bereid met 53 mg / ml anyhydrous natriumcarbonaat in gezuiverd water. Een enzym verdunningsmiddel oplossing, die van 10 mM natriumacetaatbuffer met 5mm calciumacetaat, pH 7,5, bestaat bij 37 ° C. Deze oplossing is wat we gebruiken om vast protease monsters te ontbinden of enzym-oplossingen te verdunnen. 1,1 mM L-tyrosine Standard stamoplossing. Bereid met behulp van 0,2 mg / ml L-tyrosine in gezuiverd water en voorzichtig verwarmd tot het tyrosine oplost. Net als bij de caseïne, niet koken deze oplossing. Laat de L-tyrosine standaard afkoelen tot kamertemperatuur. Deze oplossing wordt verder verdund tot onze standaard curve te maken. Protease oplossing. Vlak voor het gebruik, oplossen protease-enzym in verdunningsmiddel bereide oplossing in stap 6. Indien nodig, gebruik dan een stevige protease steekproef van vooraf bepaalde activiteit, die wordt opgelost met behulp van enzym verdunningsmiddel tot 0,1-0,2 eenheden / ml. Deze oplossing dient als een positieve controle voor de kwaliteitscontrole assay en als validatie voor de berekeningen zullen we uitvoeren om enzymactiviteit te bepalen. Het opzetten van de Protease Assay en Standard Curves Om te beginnen deze test vinden van geschikte injectieflacons die houdt ongeveer 15 ml. Voor elke enzym dat zal worden getest, zijn vier flacons nodig. Een flacon zal gebruikt worden als een blanco, en drie anderen zullen worden gebruikt om de test activiteit van drie verdunningen van het protease. Drie verdunningen zijn handig bij het controleren van definitieve berekeningen tegen elkaar. Aan elke set van vier flacons, voeg 5mls van ons 0,65% caseïne-oplossing. Laat ze in een waterbad evenwicht bij 37 ° C gedurende ongeveer 5 minuten. Voeg variërende hoeveelheden enzym-oplossing die zal worden getest om drie van het monster flacons, maar niet de blanco. Meng door zwenken en incubeer gedurende 37 ° C gedurende precies tien minuten. De protease-activiteit en als gevolg bevrijding van tyrosine in deze incubatietijd is wat er zal worden gemeten en vergeleken tussen de te testen monsters. Na deze 10 minuten incubatie, voeg de 5 ml van de TCA reagens aan elke buis om de reactie te stoppen. Voeg vervolgens een geschikt volume van enzymoplossing aan elke buis, zelfs de lege, zodat het uiteindelijke volume van het enzym oplossing in elke buis is 1 ml. Dit wordt gedaan om rekening te houden met deze extinctie van het enzym zelf en ervoor te zorgen dat de uiteindelijke volume in elke buis gelijk is. Incubeer de oplossingen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Tijdens deze 30 minuten incubatie, kunt u om uw tyrosine standaard verdunningen. Gebruik 6 dram flacons (dram flacons kan worden vervangen met polypropyleen buizen) die gemakkelijk kan houden 8 ml. Om de zes flacons, voeg de 1,1 mM tyrosine standaard voorraad oplossingen met de volgende hoeveelheden in de MLS: 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.50. Voeg geen tyrosine standaard naar de lege. Lagere normen kunnen nodig zijn voor onzuiver proefmonsters dat er weinig kleur te veranderen zal opleveren. Zodra de tyrosine standaard-oplossing is toegevoegd, voeg toe een passende hoeveelheid gezuiverd water aan elk van de normen om het volume op 2 ml te brengen. Na de 30 minuten incubatie, filter elk van de testoplossingen en de blanco met behulp van een 0,45 um polyethersulfon spuitfilter. Filtratie is nodig om een ​​onoplosbaar residu te verwijderen uit de monsters. Voeg de filtratie 2 ml van de test monsters en blanco filtraat 4 dram flesjes die ten minste 8 ml. Hetzelfde type flesje waarin de normen zijn opgesteld kan worden gebruikt. Als u alle van de injectieflacons met de normen en standaard blanco, voeg 5mls van natriumcarbonaat. Voor het beste resultaat, voeg 1 ml reagens Folin is onmiddellijk daarna. Voeg natriumcarbonaat aan een pH-daling die door de toevoeging van reagens van de Folin's te regelen. Voeg natriumcarbonaat op de proef monsters en test leeg. Deze oplossingen troebel na toevoeging van natriumcarbonaat. Voeg de Folin-reagens, die vooral zal reageren met gratis tyrosine. Meng de dram flacons door zwenken en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Na deze incubatie, dient u merkt dat de normen een gradatie van kleur correleren met de hoeveelheid tyrosine toegevoegd hebben, de hoogste concentraties van tyrosine verschijnen donkerste. U kunt ook merken aanzienlijke kleur veranderen in onze test monsters. 2mls van deze oplossingen worden gefilterd met behulp van een 0,45 um polyethersulfon spuitfilter in geschikte cuvetten. Nu dat de test is uitgevoerd, kunt u overgaan tot de spectrofotometer om onze absorptiewaarden te nemen. Meten en berekenen Absorbance enzymactiviteit De absorptie van de monsters wordt gemeten door een spectrofotometer met een golflengte van 660nm. Het licht pad is ingesteld op 1 cm. Noteer de extinctie waarden voor de normen, standaard leeg, de verschillende proefmonsters, en test leeg. Zodra alle gegevens zijn verzameld, kan de standaard curve worden gemaakt. Om de curve te genereren, verschil in absorptie tussen de standaard en standaard blanco moet worden berekend. Dit is de absorptie waarde toe te schrijven aan de hoeveelheid tyrosine in de standaard oplossingen. Na deze eenvoudige berekening maken van de standaard curve met behulp van een grafische programma om de verandering in absorptie van onze normen op de Y-as, ten opzichte van het bedrag in micromol voor elk van onze vijf normen op de X-as plot. Volume van Tyrosine Standard uMoles Tyrosine 0.05 0.055 0.10 0.111 0.20 0.221 0.40 0.442 0.50 0.553 Na de datapunten zijn ingevoerd, het genereren van een lijn van de beste pasvorm en bijbehorende helling vergelijking. Zoek de verandering in absorptie in de test monsters door het verschil te berekenen tussen het proefmonster absorptie en de absorptie van de test leeg. Het plaatsen van de extinctie voor een van de proefmonsters in de helling vergelijking en het oplossen van zal resulteren in de micromol tyrosine bevrijd tijdens deze bijzondere proteolytische reactie. Om de activiteit van het enzym in eenheden per / ml, voert u de volgende berekening: (Umole tyrosine equivalenten vrijgegeven) x (11) Eenheden / ml Enzyme = __________________________________________ (1) x (10) x (2) 11 = Totaal volume (in milliliters) van test 10 = Tijd van de test (in minuten) volgens de definitie van Unit 1 = Volume van Enzyme (in milliliter) van enzym dat wordt gebruikt 2 = Volume (in milliliter) die wordt gebruikt in de colorimetrische bepaling Neem het aantal micromol tyrosine equivalenten vrijgegeven verkregen uit de helling vergelijking en vermenigvuldigen met het totale volume van de test in de MLS, die in ons geval is 11mls. Deel deze waarde door drie andere hoeveelheden: de tijd van de test, die we renden gedurende 10 minuten, het volume van de enzym gebruikt in de test, die was gevarieerd (laten we het gebruik van 1 ml), het volume van de milliliters gebruikt in de colorimetrische detectie, die kan verschillen op basis van uw cuvette. We gebruikten 2 ml. Micromol tyrosine gedeeld door de tijd in minuten opbrengst meting van de protease activiteit genaamd "eenheden". We kunnen opheffen van de eenheden voor volume-meting in de teller en de noemer, waardoor een Measurment van de enzymactiviteit in termen van eenheden / ml. Om de activiteit in een stevige protease monster verdund in enzym verdunningsmiddel te bepalen, verdelen we onze activiteiten in eenheden / ml door de concentratie van vaste gebruikt in deze test die oorspronkelijk in mg / ml., Waardoor we met een activiteit in termen van eenheden / mg . Eenheden / ml enzym Eenheden / mg solide = _____________________ mg vaste / ml enzym