Synthesisizing Lipid Nanoparticles by Turbulent Flow in Confined Impact Jet Mixers(밀폐 충돌 제트 믹서에서 난류에 의한 지질 나노입자 합성)

최적의 LNP 제형의 스크리닝은 적절한 속도로 작동되는 경우 2스트림 CIJ 난류 혼합기를 사용하여 상대적으로 적은 양의 물질로 신속하게 달성할 수 있습니다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 프로그래밍 가능한 시린지 펌프에 의해 구동되는 μMIVM 믹서는 작은 단분산 LNP를 형성하기 위해 임계 레이놀즈 수 이상으로 충분한 미세혼합을 달성하는 것의 중요성을 강조하는 데 사용됩니다. 표 3 에는 LNP 생성에 사용되는 제형의 요약이 포함되어 있으며 믹서 설정은 3.4단계에서 설명한 프로토콜을 따릅니다. LNP 크기는 레이놀즈 수(Reynolds number)의 함수로 동적 광 산란(DLS)으로 특성화되었습니다. 그림 3B에서 볼 수 있듯이 임계 Re 5000을 넘어서면 작고 단분산 LNP가 관찰됩니다. 또한 높은 레이놀즈 수(~10,4-10,5)는 핸드헬드 조작 또는 혼합 스탠드( 그림 3B의 가장 오른쪽 데이터 포인트)를 사용하여 주사기를 균일하게 눌렀을 때 액세스할 수 있습니다. 그림 2A에 도시된 혼합 스탠드는 모든 주사기를 동시에 균일하게 누름합니다(27). 결과적으로, 이러한 LNP는 최적의 크기를 갖습니다. 부적절한 혼합으로(즉, Re가 너무 작음) 더 큰 LNP가 형성됩니다. 낮은 Re(사진 1) 및 높은 Re(사진 2)에서 형성된 LNP를 대표하는 사진이 그림 3B에 나와 있습니다. 낮은 Re에서 만든 샘플은 탁하여 큰 콜로이드 광 산란 구조(Tyndall 효과)가 있음을 나타내지만, 높은 Re에서 형성된 LNP는 작은 콜로이드의 약한 청색 편이 산란으로 인해 선명하게 보입니다. 이온화 가능한 지질은 서로 다른 물리화학적 특성을 가지며, 이는 동일한 지질 제형으로 생산된 LNP의 물리화학적 특성에 영향을 미칩니다. 이를 테스트하기 위해 CIJ 믹서(그림 1A)가 사용됩니다. 표 4 는 FDA 승인 이온화 가능한 두 가지 지질인 ALC-0315 및 MC3를 사용하여 만든 제형을 나열합니다. 그림 4A 는 ALC-0315의 pH 5에서 만든 LNP가 ~80nm인 반면, MC3를 사용하여 만든 LNP는 ~60nm임을 보여줍니다. 또한 pH 5에서 MC3-LNP는 양의 제타 전위(~28mV)를 갖는 반면 ALC-LNP는 중성 제타 전위(<10mV)를 갖습니다. 표면 전하와 LNP의 전체 크기에 대한 이러한 차이는 두 지질의 pKa에서 발생합니다. MC3는 ALC0315 (6.09)32에 비해 pKa(6.44)가 더 높습니다. 따라서 더 높은 비율의 MC3 지질은 pH 5에서 하전됩니다. 두 제형 모두 1.5 mol% PEG-지질 안정제를 함유하고; 그러나 MC3-LNP는 확산 제한 응집 중 LNP 조립 중 더 큰 정전기 반발력으로 인해 더 작은 크기에서 안정화되어 더 작은 크기에서 성장을 억제합니다. 두 제형 모두 그림 4B와 같이 높은 캡슐화 효율(>90%)을 보여줍니다. 지질의 화학적 성질은 LNP의 성능뿐만 아니라 전반적인 특성을 결정하는 데 매우 중요하므로 대상 응용 분야에 따라 신중하게 선택해야 합니다. 난류 믹서 형상(2.3단계 및 3.3단계)을 모두 사용하여 만든 LNP는 유사한 물리화학적 특성을 갖습니다. 이 비교는 벌크 피펫 혼합과 같은 불량한 혼합 기술로 만든 LNP로 더욱 확장되어 난류 혼합기와 불균일 혼합 기술의 차이점을 더욱 자세히 설명합니다(그림 1C). 표 5 는 도 5와 같이 LNP를 제조하는 데 사용되는 제형의 요약을 제공한다. 피펫 혼합 기법의 경우, 15-20초 동안 위아래로 피펫팅하여 동일한 부피의 에탄올과 수성 스트림을 빠르게 혼합한 다음 혼합물을 pH 4의 아세테이트 완충 수조에 피펫팅합니다. 그림 5A 는 퀜칭 10mM 아세테이트 완충 배조(pH 4, 10vol% 에탄올)의 LNP 크기가 사용된 믹서 형상(CIJ 또는 MIVM)에 관계없이 놀랍도록 유사하고 작다는 것을 보여줍니다(~50nm). 그러나 피펫 혼합을 사용하여 만든 LNP는 난류 믹서를 사용하여 만든 LNP의 두 배 크기입니다. 이는 서로 다른 CIJ 형상으로 만든 LNP가 충분히 높은 속도(임계 레이놀즈 수 이상의 난류 영역)에서 만들어졌을 때 유사한 특성을 나타내는 반면, 혼합이 불량하면 더 큰 다분산 LNP가 생성된다는 것을 보여줍니다. 다음으로, LNP를 10mM HEPES 완충액, pH 7.4(100배 부피)에 대해 투석하여 에탄올을 제거하고 pH를 7.4로 전환합니다. 이 과정에서, 그림 5A에서 볼 수 있듯이 일부 LNP 융합 및 약간 더 큰 크기로의 성장이 있으며, 이는 문헌33에서 잘 연구된 융합 메커니즘과 일치합니다. 전반적으로 CIJ 및 MIVM 믹서를 사용하여 만든 LNP는 100nm 미만인 반면 피펫 혼합을 사용하여 만든 LNP는 약 140nm입니다. 그림 5B에서 볼 수 있듯이 이러한 제형의 제타 전위는 10mV 미만이며, 이는 pH 7.4에서 모두 중성임을 나타냅니다. 또한 모두 >95%의 높은 캡슐화 효율을 보여줍니다(그림 5C). 따라서 최적의 물리화학적 특성을 가진 LNP는 난류 혼합기 기술을 사용하여 쉽게 제조할 수 있습니다. 이러한 LNP의 성능은 HeLa 세포에서 시험관 내 transfection을 수행하여 평가됩니다. Luciferase-based in vitro transfection assay 프로토콜은 이전 간행물34에서 채택되었습니다. 그림 6A는 표 5에 요약된 3가지 제형에 대한 1000개 셀당 발광(RLU)을 표시합니다. Lipofectamine 3000은 양성 대조군으로 사용됩니다. lipofectamine 3000은 일반적으로 DNA 제형에 사용된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 이러한 실험에서는 적절한 대조군으로 작용했습니다. 2-jet CIJ 및 4-jet MIVM 믹서를 사용하여 만든 LNP는 피펫 혼합을 사용하여 만든 LNP보다 훨씬 더 우수한 transfection을 제공합니다. LNP당 페이로드가 더 크기 때문에 큰 입자가 작은 입자보다 더 잘 transfection할 것으로 예상되지만, 여기에서 피펫 혼합을 사용하여 만든 LNP는 덜 효과적으로 transfection합니다. 이는 CIJ 기술로 만든 LNP의 구조가 피펫 혼합으로 만든 LNP와 비교했을 때 상당한 차이가 있음을 분명히 의미합니다. CIJ 및 MIVM 믹서로 만든 LNP의 transfection 효율은 본질적으로 동일합니다. Lipofectamine 3000은 가장 낮은 transfection 효율을 보여줍니다. 그림 6B는 소듐 레사주린 염35를 기반으로 한 세포 생존도 분석을 사용하여 HeLa 세포에 대한 시험관 내 LNP 독성을 평가합니다. 모든 제형은 낮은 세포 독성을 보여주며, 나노 입자 처리가 없는 대조군에 비해 살아있는 세포의 비율로 표시했을 때 높은 수준의 세포 생존율로 나타납니다. 그림 1: LNP 생산을 위한 혼합 방법. (A) 실험실에서 정기적으로 사용되는 투명 믹서와 조립된 Delrin 믹서 설정의 사진을 보여주는 2제트 제한 충돌 제트 믹서(CIJ). (B) 투명 믹서와 조립된 스테인리스강 및 Delrin 믹서 설정의 사진을 보여주는 4제트 마이크로 다중 입구 와류 믹서(μMIVM). 투명 믹서의 입구 스트림은 혼합 형상을 더 잘 시각화하기 위해 믹서의 측면으로 이동되었으며, 실제 믹서에서는 입구 스트림이 위에서 들어갑니다. CIJ와 μMIVM은 모두 흐름이 난류 영역에 있는 충분한 액체 속도로 작동하며, 혼합은 1μm보다 작은 Kolmogorov 마이크로스케일을 생성하여 ~1.5ms 내에 과포화를 달성할 수 있습니다. (C) 피펫 혼합 설정은 수용액과 에탄올 용액을 혼합하여 소량의 LNP 분산액을 준비하는 데 널리 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: μMIVM 및 믹싱 스탠드의 확장된 모습. (A) 유리 주사기가 있는 조립된 μMIVM은 주사기의 균일하고 빠른 함몰을 용이하게 하는 믹서 스탠드 아래에 있습니다. 이 그림은 Markwalter et al.29에서 재현되었습니다. (B) 내부 구성 요소를 보여주는 분해된 μMIVM. 이 혼합 형상은 입구 스트림이 측면 원통형 표면이 아닌 상단 디스크를 통해 들어간다는 점을 제외하고는 그림 1B의 투명 믹서와 동일합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 난류 믹서에서 레이놀즈 수를 증가시키면 LNP 유체역학적 직경이 고원 임계 레이놀즈 수까지 감소합니다. (A) 스트림 체적 유량을 설정하여 난류 믹서에서 레이놀즈 수를 제어하는 데 사용되는 주사기 펌프 및 μMIVM 설정의 개략도. (B) MIVM의 LNP 유체역학적 직경과 레이놀즈 수. 레이놀즈 수와 난류 에너지 소실을 늘리면 혼합이 개선되고 입자가 더 균일하게 혼합, 과포화 및 성장합니다. 임계 레이놀즈 수 이상에서는 Da<<1 조건으로 인해 유속이 증가함에 따라 LNP 크기가 일정하게 유지됩니다(즉, 용매/반용매 확산 시간이 NP 조립 시간보다 짧음). 주어진 유량은 4개 스트림 모두의 총 유량입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 다양한 이온화 가능한 지질로 생산된 LNP의 콜로이드 특성. (A) 두 가지 다른 이온화 가능한 지질인 ALC-0315 및 MC3로 생성된 LNP의 유체역학적 직경 및 제타 전위. 측정은 LNP 형성 후 담금질 수조의 pH 5에서 이루어집니다. 이온화 가능한 지질의 겉보기 pKa의 차이는 LNP의 콜로이드 특성에 영향을 미칩니다. (B) 두 LNP의 캡슐화 효율 측정(n = 3, 오차 막대는 하나의 표준 편차를 나타냄). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5: MC3 이온화 가능한 지질을 사용하여 루시페라아제 mRNA를 캡슐화하는 다양한 믹서로 생산된 LNP의 콜로이드 특성. (A) 2-jet, 4-jet 및 피펫 믹서로 생산된 LNP의 유체역학적 직경. 측정은 LNP 형성 후(왼쪽)와 중성 HEPES 완충액으로 투석한 후(오른쪽) 담금질 수조의 산성 조건에서 수행됩니다. LNP 크기는 이온화 가능한 지질의 탈이온화로 인해 pH 중화 중에 증가하여 LNP 융합 및 성장으로 이어집니다. 지질-PEG 안정제는 미크론 크기의 침전물이 형성되기 전에 이 입자 유착 성장을 억제합니다. (B) 10mM HEPES, pH 7.4 조건에서 투석된 LNP에 대한 표면 전하 측정(전위ζ). 모든 LNP는 0mV에서 2mV 내에 있으며, 이는 이러한 입자 표면이 중성이며 거의 검출할 수 없는 양의 양이온 전하만 있음을 나타냅니다. (C) LNP 투석 후 캡슐화 효율 측정(n = 3, 오차 막대는 1 표준 편차를 나타냄). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 6: 준비된 LNP를 사용한 HeLa 세포의 transfection. (A) 루시페린으로 처리한 후 발현된 루시페라아제 효소의 발광. (B) LNP로 배양 한 후 HeLa 세포의 생존력. 세포는 resazurin 대사 분석에 의해 표시된 바와 같이 생존력에서 통계적으로 유의한 변화를 보이지 않습니다 (n = 4, 오차 막대는 1 표준 편차를 나타냄). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 스트림 /담금질 목욕 구성 요소 정립 주식 음량 주사기 1 -에탄올 스트림(총 지질 6mg/mL) 이온화 가능한 지질(MC3) 50 몰 % 50mg/mL 0.5 mL Zwitterion 지질 (DSPC) 10 몰 % 5mg/mL 콜레스테롤 38.5 몰 % 5mg/mL 페길화 지질(DMG-PEG2000) 1.5 몰 % 4mg/mL 주사기 2 -수성 스트림(0.3mg/mL RNA) 효모 RNA 해당 없음 6 10mg/mL 0.5 mL 아세테이트 버퍼 20mM, pH 4 100 mM, pH 4 담금질 목욕 아세테이트 버퍼 10mM, pH 4 100 mM, pH 4 4mL 표 1: CIJ 믹서에 의해 생산된 표준 파티시란 LNP 제형. 효모 RNA는 이 프로토콜의 모델 RNA로 사용됩니다. 모든 용액은 분자적으로 용해되고 완전히 혼합된 후 주사기에 넣습니다. 스트림 /담금질 목욕 구성 요소 정립 주식 음량 주사기 1 -에탄올 스트림(총 지질 6mg/mL) 이온화 가능한 지질(MC3) 50 몰 % 50mg/mL 0.5 mL Zwitterion 지질 (DSPC) 10 몰 % 5mg/mL 콜레스테롤 38.5 몰 % 5mg/mL 페길화 지질(DMG-PEG2000) 1.5 몰 % 4mg/mL 주사기 2 -수성 스트림(0.3mg/mL RNA) 효모 RNA 해당 없음 6 10mg/mL 0.5 mL 아세테이트 버퍼 20mM, pH 4 100 mM, pH 4 주사기 3 -에탄올 스트림(총 지질 6mg/mL) 이온화 가능한 지질(MC3) 50 몰 % 50mg/mL 0.5 mL Zwitterion 지질 (DSPC) 10 몰 % 5mg/mL 콜레스테롤 38.5 몰 % 5mg/mL 페길화 지질(DMG-PEG2000) 1.5 몰 % 4mg/mL 주사기 4 -수성 스트림(0.3mg/mL RNA) 효모 RNA 해당 없음 6 10mg/mL 0.5 mL 아세테이트 버퍼 20mM, pH 4 100 mM, pH 4 담금질 목욕 아세테이트 버퍼 10mM, pH 4 100 mM, pH 4 8 mL 표 2: MIVM 믹서에 의해 생산된 표준 파티시란 LNP 제형. MIVM 믹서는 2개의 용매와 2개의 반용매의 4가지 스트림을 사용합니다. 모멘타가 같지 않은 스트림을 사용할 수 있습니다. 그러나 이 프로토콜에 대해 동일한 모멘텀을 가진 스트림이 선택됩니다. 스트림 /담금질 목욕 구성 요소 정립 주식 음량 주사기 1 -에탄올 스트림(총 지질 6mg/mL) 이온화 가능한 지질(MC3) 50 몰 % 50mg/mL 20mL Zwitterion 지질 (DSPC) 10 몰 % 5mg/mL 콜레스테롤 38.5 몰 % 5mg/mL 페길화 지질(DMG-PEG2000) 1.5 몰 % 4mg/mL 주사기 2 -수성 스트림(0.3mg/mL RNA) 효모 RNA 해당 없음 6 10mg/mL 20mL 아세테이트 버퍼 20mM, pH 4 100 mM, pH 4 주사기 3 -에탄올 스트림(총 지질 6mg/mL) 이온화 가능한 지질(MC3) 50 몰 % 50mg/mL 20mL Zwitterion 지질 (DSPC) 10 몰 % 5mg/mL 콜레스테롤 38.5 몰 % 5mg/mL 페길화 지질(DMG-PEG2000) 1.5 몰 % 4mg/mL 주사기 4 -수성 스트림(0.3mg/mL RNA) 효모 RNA 해당 없음 6 10mg/mL 20mL 아세테이트 버퍼 20mM, pH 4 100 mM, pH 4 담금질 목욕(회수 시간= 30초) HEPES 완충액 10mM, pH 7.5 1m, pH 7.5 320mL 표 3: 주사기 펌프로 구동되는 MIVM 믹서에 의해 생성된 LNP 제형. DODMA는 모델 RNA로 효모 RNA와 함께 이온화 가능한 지질로 사용됩니다. 이 프로토콜에 대해 40mL/min으로 실행하는 예가 선택됩니다. 스트림 /담금질 목욕 구성 요소 정립 주식 음량 주사기 1 -에탄올 스트림(총 지질 12mg/mL) 이온화 가능한 지질(MC3 또는 ALC0315) 50 몰 % 50mg/mL 0.5 mL Zwitterion 지질 (DSPC) 10 몰 % 5mg/mL 콜레스테롤 38.5 몰 % 5mg/mL 페길화 지질(DMG-PEG2000) 1.5 몰 % 4mg/mL 주사기 2 -수성 스트림(0.6mg/mL RNA) 효모 RNA 해당 없음 6 10mg/mL 0.5 mL 아세테이트 버퍼 20 mM, pH 5 100 mM, pH 5 담금질 목욕 아세테이트 버퍼 10 mM, pH 5 100 mM, pH 5 9mL 표 4: CIJ 믹서에서 생산된 두 가지 서로 다른 이온화 가능한 지질의 LNP 제형. 제형은 ALC-0315 또는 MC3로 만들어지며 다른 모든 구성 요소는 동일하게 유지됩니다. 스트림 /담금질 목욕 구성 요소 정립 주식 음량 주사기 1 -에탄올 스트림(총 지질 6mg/mL) 이온화 가능한 지질(MC3) 50 몰 % 50mg/mL 0.5 mL Zwitterion 지질 (DSPC) 10 몰 % 5mg/mL 콜레스테롤 38.5 몰 % 5mg/mL 페길화 지질(DMG-PEG2000) 1.5 몰 % 4mg/mL 주사기 2 -수성 스트림(0.3mg/mL RNA) FLuc mRNA (플룩 mRNA) 해당 없음 6 1mg/mL 0.5 mL 아세테이트 버퍼 20mM, pH 4 100 mM, pH 4 담금질 목욕 아세테이트 버퍼 10mM, pH 4 100 mM, pH 4 4mL 표 5: CIJ 믹서에 의해 생산된 표준 파티시란 LNP 제형. 루시페라아제 단백질을 발현하는 FLuc mRNA는 생물발광 분석을 사용하여 유전자 발현을 측정하는 데 사용됩니다. 보충 파일 1: CIJ 및 MIVM 믹서 공급업체. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.