Ensamblaje de organoides de la retina con microglía
Summary
La microglía es una célula inmunitaria residente única en la retina que desempeña un papel crucial en diversas enfermedades degenerativas de la retina. La generación de un modelo de cocultivo de organoides retinianos con microglía puede facilitar una mejor comprensión de la patogénesis y el progreso del desarrollo de las enfermedades de la retina.
Abstract
Debido a la accesibilidad limitada de la retina humana, los organoides retinianos (RO) son el mejor modelo para estudiar la enfermedad de la retina humana, que podría revelar el mecanismo del desarrollo de la retina y la aparición de la enfermedad de la retina. La microglía (MG) son macrófagos residentes únicos en la retina y el sistema nervioso central (SNC), que cumplen funciones inmunitarias cruciales. Sin embargo, los organoides de la retina carecen de microglía ya que su origen de diferenciación es el saco vitelino. La patogenia específica de la microglía en estas enfermedades de la retina sigue sin estar clara; Por lo tanto, resulta necesario el establecimiento de un modelo de organoide retiniano incorporado a la microglía. Aquí, construimos con éxito un modelo de cocultivo de organoides de retina con microglía derivada de células madre humanas. En este artículo, diferenciamos la microglía y luego la cocultivamos en organoides retinianos en la etapa inicial. Como incorporación de células inmunitarias, este modelo proporciona una plataforma optimizada para el modelado de enfermedades de la retina y el cribado de fármacos para facilitar la investigación en profundidad sobre la patogénesis y el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la retina y el SNC.
Introduction
Como fuente limitada de la retina humana, la diferenciación de las células madre humanas en organoides retinianos tridimensionales (3D) representa un modelo in vitro prometedor para simular la retina1. Contiene diferentes tipos de células en la retina, incluidos fotorreceptores, células ganglionares de la retina, células bipolares, células de Müller, células horizontales y astrocitos2. Este modelo permite emular y estudiar tanto los mecanismos de desarrollo de la retina como la patogénesis de las enfermedades de la retina. Sin embargo, debido al método de diferenciación direccional, los organoides de la retina se derivaron del neuroectodermo3, careciendo de muchos otros tipos de células que se originan en diferentes capas germinales, como la microglía del saco vitelino y las células perivasculares del mesodermo 4,5,6.
En la actualidad, se ha demostrado que muchas enfermedades de la retina, como la retinosis pigmentaria7, el glaucoma8 y el retinoblastoma9, están estrechamente relacionadas con la microglía dentro de la retina. Sin embargo, debido a la falta de modelos de investigación adecuados, los mecanismos específicos que ilustran la relación entre la microglía y estas enfermedades aún no están claros. Si bien los ratones han servido como un modelo favorable para el estudio de las enfermedades de la retina, estudios recientes han destacado diferencias significativas entre la microglía de ratón y la humana en términos de esperanza de vida, tasa de proliferación y ausencia de genes homólogos humanos10,11. Estos hallazgos sugirieron que las conclusiones extraídas de modelos de ratón pueden no ser del todo fiables, lo que pone de relieve la importancia de construir organoides de retina humana que contengan microglía.
En las últimas décadas, se han desarrollado diversos métodos para la diferenciación 3D de organoides retinianos12,13. Para facilitar la operación de cocultivo de microglía dentro de organoides de retina, hemos seleccionado un método de diferenciación que implica una transición de cultivo adherente a cultivo en suspensión. Este enfoque permite con éxito la incorporación de la microglía a los organoides de la retina, manteniéndolos durante al menos 60 días14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Debido a la disponibilidad restringida de la retina humana, nuestra comprensión actual de las respuestas inflamatorias de la retina casi proviene de modelos animales. Para superar esta limitación, se diferenciaron los organoides de la retina. El desarrollo de modelos de organoides retinianos ha sido un área activa de investigación, con el objetivo de recapitular la complejidad de la retina humana para el modelado de enfermedades y el desarrollo terapéutico. Varios estudios han reportado la generación exitosa de org…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82101145) y la Fundación de Ciencias Naturales de Pekín (Z200014).
Materials
| Acctuase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634-010 | |
| Anti-CRX(M02) | abnova | H00001406-M02 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| Anti-IBA1 | Abcam | ab5076 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| B27 | Life Technologies | 17105-041 | |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 07923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-042 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| FBS | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Gelatin | Sigma | G7041-100G | Solid |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| H9 cell line | WiCell Research Institute | ||
| IL-3 | RD Systems | 203-IL-050 | |
| IL-34 | PeproTech | 200-34-50UG | |
| KSR | Gibco | 10828028 | |
| Matrix | Corning | 356231 | |
| M-CSF | RD Systems | 216-MC-500 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution | Sigma | M7145 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Stem cell medium | Stemcell Technologies | 5990 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| X-ViVO | LONZA | 04-418Q | |
| Y27632 | Selleck | S1049 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
References
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