Assemblierung von Netzhaut-Organoiden mit Mikroglia
Summary
Mikroglia sind einzigartige residente Immunzellen in der Netzhaut, die eine entscheidende Rolle bei verschiedenen degenerativen Erkrankungen der Netzhaut spielen. Die Generierung eines Co-Kulturmodells von retinalen Organoiden mit Mikroglia kann ein besseres Verständnis der Pathogenese und des Entwicklungsfortschritts von Netzhauterkrankungen ermöglichen.
Abstract
Aufgrund der eingeschränkten Zugänglichkeit der menschlichen Netzhaut sind retinale Organoide (ROs) das beste Modell für die Untersuchung menschlicher Netzhauterkrankungen, das den Mechanismus der Netzhautentwicklung und das Auftreten von Netzhauterkrankungen aufdecken könnte. Mikroglia (MG) sind einzigartige residente Makrophagen in der Netzhaut und im Zentralnervensystem (ZNS), die wichtige Immunfunktionen erfüllen. Retinalen Organoiden fehlen jedoch Mikroglia, da ihr Differenzierungsursprung der Dottersack ist. Die spezifische Pathogenese von Mikroglia bei diesen Netzhauterkrankungen ist noch unklar; Daher erweist sich die Etablierung eines Mikroglia-eingebauten retinalen Organoidmodells als notwendig. Hier ist es uns gelungen, ein co-kultiviertes Modell von Netzhaut-Organoiden mit Mikroglia zu konstruieren, die aus menschlichen Stammzellen gewonnen wurden. In diesem Artikel haben wir Mikroglia differenziert und dann im Frühstadium zu retinalen Organoiden cokultiviert. Als Integration von Immunzellen bietet dieses Modell eine optimierte Plattform für die Modellierung von Netzhauterkrankungen und das Wirkstoffscreening, um eine eingehende Erforschung der Pathogenese und Behandlung von Netzhaut- und ZNS-bedingten Erkrankungen zu ermöglichen.
Introduction
Die Differenzierung menschlicher Stammzellen in dreidimensionale (3D) Netzhautorganoide stellt als begrenzte Quelle der menschlichen Netzhaut ein vielversprechendes in vitro Modell zur Simulation der Netzhautdar 1. Es enthält verschiedene Zelltypen in der Netzhaut, darunter Photorezeptoren, retinale Ganglienzellen, bipolare Zellen, Müller-Zellen, horizontale Zellen und Astrozyten2. Dieses Modell ermöglicht die Emulation und Untersuchung sowohl der Entwicklungsmechanismen der Netzhaut als auch der Pathogenese von Netzhauterkrankungen. Aufgrund der gerichteten Differenzierungsmethode wurden jedoch retinale Organoide aus dem Neuroektoderm3 abgeleitet, wobei viele andere Zelltypen, die aus verschiedenen Keimblättern stammen, wie z.B. Mikroglia aus dem Dottersack und perivaskuläre Zellen aus dem Mesoderm 4,5,6, fehlen.
Gegenwärtig ist bei vielen Netzhauterkrankungen wie Retinitis pigmentosa7, Glaukom8 und Retinoblastom9 nachgewiesen, dass sie eng mit den Mikroglia in der Netzhaut zusammenhängen. Aufgrund des Mangels an geeigneten Forschungsmodellen sind die spezifischen Mechanismen, die den Zusammenhang zwischen Mikroglia und diesen Krankheiten veranschaulichen, jedoch noch unklar. Während Mäuse als günstiges Modell für die Untersuchung von Netzhauterkrankungen dienten, haben neuere Studien signifikante Unterschiede zwischen Maus- und menschlichen Mikroglia in Bezug auf Lebensdauer, Proliferationsrate und das Fehlen menschlicher homologe Gene hervorgehoben10,11. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Schlussfolgerungen aus Mausmodellen möglicherweise nicht ganz zuverlässig sind, was die Bedeutung der Konstruktion menschlicher Netzhautorganoide mit Mikroglia unterstreicht.
In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene Methoden zur 3D-Differenzierung von retinalen Organoiden entwickelt12,13. Um den Co-Kulturbetrieb von Mikroglia innerhalb von retinalen Organoiden zu erleichtern, haben wir eine Differenzierungsmethode gewählt, die einen Übergang von adhärenter zu Suspensionskultur beinhaltet. Dieser Ansatz ermöglicht es, Mikroglia erfolgreich in die retinalen Organoide einzubauen und sie mindestens 60 Tage lang zu erhalten14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aufgrund der eingeschränkten Verfügbarkeit der menschlichen Netzhaut stammt unser heutiges Verständnis von retinalen Entzündungsreaktionen fast aus Tiermodellen. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden retinale Organoide differenziert. Die Entwicklung von Netzhaut-Organoidmodellen ist ein aktives Forschungsgebiet, das darauf abzielt, die Komplexität der menschlichen Netzhaut für die Modellierung von Krankheiten und die therapeutische Entwicklung zu rekapitulieren. Mehrere Studien haben über die erfolgreiche…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wird von der National Natural Science Foundation of China (82101145) und der Beijing Natural Science Foundation (Z200014) unterstützt.
Materials
| Acctuase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634-010 | |
| Anti-CRX(M02) | abnova | H00001406-M02 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| Anti-IBA1 | Abcam | ab5076 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| B27 | Life Technologies | 17105-041 | |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 07923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-042 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| FBS | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Gelatin | Sigma | G7041-100G | Solid |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| H9 cell line | WiCell Research Institute | ||
| IL-3 | RD Systems | 203-IL-050 | |
| IL-34 | PeproTech | 200-34-50UG | |
| KSR | Gibco | 10828028 | |
| Matrix | Corning | 356231 | |
| M-CSF | RD Systems | 216-MC-500 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution | Sigma | M7145 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Stem cell medium | Stemcell Technologies | 5990 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| X-ViVO | LONZA | 04-418Q | |
| Y27632 | Selleck | S1049 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
References
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