Impianto di dispositivi optoelettronici nel midollo spinale del roditore

Tutte le procedure sono state condotte secondo le linee guida del Canadian Council for Animal Care e supervisionate dal Comitato per la cura degli animali dell’Università della British Columbia. Le femmine di ratto Long-Evans, del peso di 350-450 g e di età compresa tra 6 e 8 mesi, sono state alloggiate in gruppo (21 °C; 12 h:12 h ciclo di luce) e hanno avuto accesso ad libitum a una dieta standard per roditori prima e dopo l’intervento chirurgico. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate per questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali. 1. Preparazione pre-operatoria Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici utilizzando un’autoclave. Anestetizzare l’animale con isoflurano (5% per induzione e 2% per mantenimento) somministrato in ossigeno ad una portata di 1 L/min. Trasferire l’animale dalla camera di induzione a un termoforo e collegare prontamente il cono di naso dell’isoflurano. Verificare che l’animale sia sotto un piano chirurgico di anestesia assicurando una completa perdita del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi su entrambe le gambe. Radere la parte posteriore del ratto partendo dalla base delle orecchie, come mostrato nella Figura 2A. Applicare una generosa quantità di unguento sterile sugli occhi e iniettare buprenorfina (diluita a 0,03 mg/kg) e 10 ml di ringer lattato per via sottocutanea (riscaldata a temperatura corporea). Pulire l’area rasata con uno scrub chirurgico antisettico (clorexidina) seguito da alcol isopropilico con un movimento circolare partendo dal centro dell’area rasata e allargando il diametro del cerchio. Ripeti il processo sapone/alcol altre due volte. Fissare l’animale in un telaio stereotassico, posizionando la testa utilizzando barre auricolari lubrificate per la stabilità (Figura 2A).NOTA: Durante l’intera procedura, fornire costantemente supporto termico, verificare la profondità dell’anestesia tramite il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi e monitorare i segni vitali. Posizionare un telo chirurgico sterile sopra l’animale. 2. Esposizione del midollo spinale cervicale Usando una pinza sterile, inizia palpando la base del cranio. Sentire un processo spinoso prominente che si estende rostrocaudalmente vicino alla base del cranio; questo è C214 (Figure 1B e Figura 2B). Procedere con la palpazione caudale a C2 per trovare un processo spinoso notevolmente acuto e appuntito, identificabile come T215 (Figure 1B e Figura 2C). Utilizzando un bisturi, creare un’incisione nella pelle, partendo da C2 e estendendosi caudalmente per circa 1,5 cm (Figura 2D).NOTA: La dimensione dell’incisione può variare tra animali di dimensioni diverse. Assicurarsi in anticipo dell’identificazione dei punti di riferimento anatomici e procedere di conseguenza. Tagliare con cura lo strato adiposo sottocutaneo con il bisturi per esporre la muscolatura dorsale sottostante intatta. Una volta che i muscoli dorsali sono esposti, eseguire la dissezione smussata separandoli dalla linea mediana utilizzando due pinze Adson (Figura 2E).NOTA: È importante eseguire la dissezione contundente (separando le fibre muscolari) piuttosto che tagliare i muscoli per ridurre al minimo il sanguinamento. Un’adeguata esposizione della muscolatura dorsale dovrebbe rivelare un muscolo a forma di palla (Figura 2G). Questo muscolo copre completamente il C2 e copre parzialmente il C3. Utilizzando rongeur e pinze sterili, sollevare immediatamente un lembo di pelle caudale all’area incisa. Utilizzare i rongeurs per creare una piccola tasca sottocutanea: questa sarà la posizione del dispositivo (Figura 2F).NOTA: La tasca sottocutanea deve essere più grande del dispositivo stesso. Si raccomanda che il chirurgo o i chirurghi si riposizionino in modo da affrontare l’animale anteriormente per migliorare il controllo e la visibilità durante l’apertura della tasca sottocutanea. Posizionare un divaricatore per esporre la colonna vertebrale (Figura 2G). Usando i rongeurs, rimuovi eventuali muscoli o tessuti rimanenti che coprono le vertebre e inizia a identificare i segmenti del midollo spinale. Immediatamente caudale al muscolo a forma di palla c’è C4, seguito da C5 e C6 (Figura 2G-I). Una volta completato, sciacquare l’area chirurgica con soluzione fisiologica sterile e asciugare con una garza sterile.NOTA: Il muscolo a forma di palla avvolge completamente C2 e si estende parzialmente su C3. Il segmento del midollo spinale direttamente caudale ad esso, con un contatto minimo, è designato come C4. Eseguire laminectomie a seconda dello scopo previsto della sonda.Per una sonda sotto la lamina, eseguire una laminectomia laterale a C5 e C6, creando un’apertura lateralizzata nella lamina per il futuro posizionamento della sonda (Figura 2H, Figura 1A supplementare). Per una sonda sopra la lamina, eseguire una laminectomia mediale di C5, assicurandosi di non rimuovere gli aspetti laterali del processo spinoso, esponendo semplicemente un percorso mediale per il posizionamento della sonda (Figura 2I, Figura 1B supplementare). Dopo la laminectomia, sciacquare la regione con soluzione fisiologica sterile e asciugare con una garza sterile per rimuovere eventuali detriti ossei.NOTA: Quando si esegue la laminectomia, è fondamentale spingere i rongeur contro l’osso ed evitare qualsiasi movimento verso il basso per evitare danni al cordone. 3. Posizionamento epidurale del dispositivo Tenere il dispositivo sterile con una pinza sterile con punta in plastica (Figura 3A) e inserirlo all’interno dell’apertura sottocutanea praticata in precedenza al punto 2.9.NOTA: È fondamentale evitare di toccare il dispositivo con guanti/strumenti non sterili per mantenere la sterilità del dispositivo. Utilizzare una pinza sterile designata per il posizionamento del dispositivo e il posizionamento sotto la pelle. Sutura o incolla il dispositivo allo strato muscolare vicino per mantenerlo sicuro (Figura 3B).NOTA: Utilizzare suture non assorbibili se si sutura il dispositivo ai muscoli. In caso contrario, il dispositivo è soggetto a movimenti dopo l’assorbimento della sutura nel corpo. Se si utilizza la colla, garantire la stabilità e la biocompatibilità a lungo termine della colla/adesivo. Evitare di fissare il dispositivo allo strato adiposo sottocutaneo per garantire punti di ancoraggio affidabili.Pianificare la posizione del corpo del dispositivo prima di procedere con questo passaggio. Poiché il dispositivo sarà fissato in modo permanente, possono sorgere problemi con il posizionamento della sonda (passaggio 3.4) se il dispositivo si trova troppo vicino o troppo lontano dal livello desiderato al midollo spinale. Posizionare il divaricatore attorno al midollo spinale e aprire una finestra adatta per posizionare la sonda sul midollo spinale. Posizionamenti delle sonde:Posizionamento della sonda sotto la lamina: inserire con cautela la sonda utilizzando una pinza con punta in plastica sotto le lamine (C5 e C6) facendola scorrere attraverso i canali lateralizzati realizzati al punto 2.9.1 (Figura 3D). Posizionamento della sonda sopra il midollo spinale:Regolare la sonda utilizzando una pinza con punta in plastica per allinearla e posizionarla sulla parte superiore della finestra mediale creata in C5 al punto 2.9.2 (Figura 3C). In un contenitore sterile, piccolo e preferibilmente di ceramica, preparare il cemento mescolando un misurino di polvere di cemento dentale, 3 gocce di grasso ad alta tecnologia e una goccia di catalizzatore. Mescolare con stuzzicadenti sterili fino a ottenere una consistenza viscosa.NOTA: Si raccomanda vivamente che una persona che non sta eseguendo l’intervento chirurgico prepari il cemento in modo che il chirurgo possa tenere la sonda in posizione e asciugare l’area desiderata immediatamente prima di applicare il cemento. Questo passaggio è sensibile al fattore tempo. Assicurarsi che il chirurgo posizioni la sonda prima di preparare il cemento. Una volta applicato il catalizzatore, il cemento si addenserà troppo per legarsi efficacemente con l’osso in caso di ritardo. Esercitarsi con il cemento prima dell’intervento chirurgico per assicurarsi di ottenere la giusta consistenza prima di posizionarlo sulla sonda/osso. Asciugare completamente l’area di cementazione prevista sulle vertebre per creare un punto di ancoraggio affidabile. Applicare 1-2 gocce di cemento dentale sulla punta della sonda, che deve essere posizionata sopra il livello vertebrale previsto, in questo caso C4 (Figura 3C, D).NOTA: È fondamentale che le vertebre siano il più asciutte possibile prima della cementazione. In caso contrario, il cemento non aderirà e la sonda non sarà fissata. Mettere in pausa per 30 s e toccare delicatamente il cemento per verificare che sia indurito. Se il cemento non è completamente indurito, attendere altri 20 s e riapplicare il cemento appena fatto fino a quando la sonda non è saldamente fissata all’osso.NOTA: Il cemento si è incollato correttamente quando diventa duro e rigido al tatto.ATTENZIONE: L’applicazione del cemento quando è troppo liquido può provocarne l’infiltrazione nel tessuto del midollo spinale tra le vertebre. In tal caso, attendere circa 10 secondi affinché il cemento si addensi fino a ottenere una consistenza più simile a una gomma prima di utilizzare delicatamente una pinza per rimuovere il cemento che è entrato in contatto con il midollo spinale. 4. Procedure post-chirurgiche Una volta completato l’intervento chirurgico, suturare il sito di incisione utilizzando suture vicryl 5-0. Rimuovere delicatamente l’animale dall’apparato stereotassico e trasferirlo in una camera di recupero riscaldata. Per i primi 3-5 giorni dopo l’intervento, fornire all’animale cibo morbido e inumidito, dolcetti e acqua idrogel. Monitorare attentamente l’animale due volte al giorno durante la prima settimana dopo l’intervento. Somministrare buprenorfina e iniezioni di Ringer lattato riscaldate due volte al giorno per i successivi 2 giorni, o più a lungo se persistono segni di dolore. Continuare i controlli giornalieri fino a quando l’animale non mostra problemi clinici di salute. Successivamente, controlla l’animale almeno una volta alla settimana. (Facoltativo) Delineare il perimetro del dispositivo sulla pelle dopo l’intervento chirurgico e la chiusura dell’incisione per un’indicazione visiva della posizione del dispositivo nel corpo (Figura 4A).NOTA: Questo passaggio è particolarmente utile quando il dispositivo richiede l’accesso esterno, come dispositivi che devono essere alimentati in modalità wireless tramite un trasmettitore esterno in cui l’accoppiamento dell’antenna è fondamentale, o pompe di erogazione del farmaco che devono essere ricaricate attraverso la pelle 16,17,18.